Oxyde de graphène

Rapports scientifiques volume 6, Numéro d'article : 21867 (2016) Citer cet article

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L'oxyde de graphène (GO) est réduit par certaines bactéries exoélectrogènes, mais ses effets sur la croissance bactérienne et le métabolisme sont une question controversée. Cette étude visait à déterminer si GO fonctionne comme accepteur d'électrons terminal pour permettre la croissance spécifique et la production d'électricité par des bactéries exoélectrogènes. La culture d'échantillons environnementaux avec du GO et de l'acétate comme seul substrat pourrait enrichir spécifiquement les bactéries exoélectrogènes avec une prédominance des espèces de Geobacter (51 à 68 % des populations totales). Fait intéressant, les bactéries de ces cultures se sont auto-agrégées en un complexe d'hydrogel conducteur avec du GO biologiquement réduit (rGO). Une nouvelle bactérie respiratoire GO désignée Geobacter sp. la souche R4 a été isolée de ce complexe d'hydrogel. Cet organisme a présenté une production d'électricité stable à> 1000 μA / cm3 (à 200 mV vs Ag / AgCl) pendant plus de 60 jours via rGO tout en produisant temporairement de l'électricité à l'aide de feutre de graphite. La meilleure production d'électricité dépend des caractéristiques de rGO telles qu'une grande surface pour la croissance du biofilm, une plus grande capacité et une plus petite résistance interne. Il s'agit du premier rapport à démontrer la croissance dépendante de GO de bactéries exoélectrogènes tout en formant un complexe d'hydrogel conducteur avec rGO. Le simple processus de mise en attente conduisant à la formation de complexes d'hydrogel de rGO et d'exoélectrogènes permettra des applications plus larges de GO aux systèmes bioélectrochimiques.

Les systèmes bioélectrochimiques (BES)1 ou systèmes électrochimiques microbiens (MES)2 sont les dispositifs de réactions électrochimiques utilisant des micro-organismes comme catalyseurs. Les piles à combustible microbiennes (MFC) sont un représentant des BES qui génèrent des électrons vers une électrode via l'oxydation microbienne de composés organiques3. Les bactéries exoélectrogènes sont caractérisées par leur fonction unique appelée transfert d'électrons extracellulaire (EET)4 et sont des médiateurs dans la production d'électricité dans les BES. Les membres des genres Geobacter et Shewanella sont les exoélectrogènes les plus étudiés qui peuvent transférer des électrons directement par fixation à l'électrode et indirectement via des médiateurs redox5,6.

La performance des BES est principalement associée à l'EET dans les biofilms bactériens se développant sur l'électrode mais moins à l'EET indirect par les cellules planctoniques au sein de l'appareil7. Par conséquent, le matériau d'électrode est un déterminant important de la formation de biofilms et de la performance du transfert d'électrons sur l'interface cellule-électrode. Étant donné que les électrodes en carbone sont chimiquement stables et bonnes pour le développement de biofilms bactériens, ce type d'électrodes a de préférence été appliqué aux BES8,9. En particulier, le feutre de graphite, la brosse en carbone et le tissu en carbone ont été pris en compte pour une utilisation pratique en raison de leur disponibilité commerciale, de leurs performances expérimentales et de leurs avantages économiques. L'un des facteurs importants pouvant affecter les performances des électrodes est la surface. Une électrode ayant une plus grande surface peut permettre la fixation de plus de cellules bactériennes que celle du carbone nu ou du graphite10. Un progrès technique récent dans ce domaine de recherche est la modification de l'anode en utilisant des dérivés de graphène qui présentent des performances supérieures11,12,13.

Le graphène, un réseau en nid d'abeille monocouche d'atome de carbone, présente les avantages d'avoir une conductivité élevée et de grandes surfaces à différents ordres de grandeur, par exemple 2965 m2/g pour le graphène14 et 0,02 m2/g pour le feutre de graphite10. Cependant, il est difficile d'appliquer le graphène directement aux BES, car il s'agit d'une poudre hydrophobe et doit être un complexe avec des électrodes de support pour une utilisation dans les BES. Il a été démontré que l'ajout d'oxyde de graphène (GO), la forme oxydée du graphène, à la chambre de réaction dans les BES améliore le transfert d'électrons vers l'électrode de carbone15,16. GO lui-même n'est pas électriquement conducteur mais devient conducteur lorsqu'il est réduit par des micro-organismes17,18. Ici, cette forme réduite de GO est désignée simplement comme GO réduit (rGO), car aucune information sur son identité chimique n'est disponible. La réduction bactérienne de GO a d'abord été démontrée dans des cultures d'espèces de Shewanella et plus tard dans Escherichia coli19 et des populations mixtes complexes20. Les espèces de Shewanella ont réduit le GO en utilisant la protéine redox impliquée dans EET17,18. De plus, le GO a été réduit dans l'extrait acellulaire d'une culture de Shewanella17, peut-être par de petites biomolécules comme la vitamine C21. Ces découvertes soulèvent la question de savoir si GO sert d'accepteur d'électrons pour le couplage EET avec l'oxydation du substrat chez les bactéries exoélectrogènes, permettant ainsi leur croissance. Jusqu'à présent, la croissance bactérienne par respiration GO n'a pas encore été pleinement démontrée. D'autre part, il a également été démontré que le GO a des activités antibactériennes ou bactéricides22,23. Ces résultats fournissent une autre hypothèse selon laquelle GO fonctionne comme un simple puits d'électrons mais pas comme un accepteur d'électrons terminal pour permettre la croissance respiratoire. Par conséquent, les informations sur les effets du GO sur la croissance bactérienne et le métabolisme sont fragmentaires et indéfinies à l'heure actuelle. Cette situation a restreint l'application de GO aux BES.

GO a des avantages potentiellement plus importants que le graphène dans l'application aux BES, en partie parce que GO est plus économique que le graphène et en partie parce que l'hydrophilie de GO peut permettre la fixation de plus de cellules bactériennes à sa surface dans des solutions aqueuses. Si GO peut fonctionner comme un accepteur d'électrons terminal soutenant la croissance de bactéries exoélectrogènes, GO peut être utile pour l'enrichissement sélectif de ces bactéries à partir de l'environnement. En outre, il est très intéressant de noter que GO s'est auto-agrégé en un hydrogel lorsqu'il est chimiquement réduit dans des solutions aqueuses24. Cela nous fait nous attendre à ce que GO soit utilisable pour la formation d'un complexe d'assemblage à haute densité d'exoélectrogènes conduisant les EET et de rGO conducteur.

Le but principal de cette étude était de déterminer si la croissance sélective et l'auto-agrégation des bactéries exoélectrogènes ont lieu en fonction de GO. À cette fin, nous avons tenté de faire des cultures d'enrichissement de bactéries GO-respiration (GORB) à partir de l'environnement et avons examiné ces GORB pour la production d'électricité via EET à l'électrode. La composition phylogénétique des GORBs enrichis a été déterminée par séquençage à haut débit des amplicons du gène de l'ARNr 16S. Comme indiqué ici, nos tentatives de fabrication d'un complexe d'hydrogel conducteur de GORB et de rGO ont donné des résultats positifs. À notre connaissance, cette étude est la première à démontrer la croissance dépendante de GO de bactéries exoélectrogènes accompagnée d'une auto-agrégation dans un complexe d'hydrogel avec rGO capable de produire de l'électricité.

Les échantillons GO utilisés dans cette étude ont été obtenus dans le commerce sous forme de poudre et dispersés dans l'eau par sonication pendant 2 h. Le GO préparé consistait presque en des feuilles monocouches d'une épaisseur de 1, 5 nm, comme le montrent les images AFM, et présentait d'abondants pics C = O à 287 eV et un pic CC / CH à 285 eV en XPS (Fig. S1 supplémentaire). La surface des feuillets GO était variable avec une moyenne de 0,26 ± 0,46 μm.

Pour enrichir les GORB à partir d'échantillons environnementaux, l'acétate a été utilisé comme seule source de carbone et d'énergie. Les potentiels redox de l'acétate et d'un GO chimiquement réduit étaient de -290 mV25 et +380 mV26 vs SHE (électrode à hydrogène standard), respectivement. La différence de potentiel de réduction entre les deux est thermodynamiquement favorable à la génération d'énergie et à la croissance résultante par couplage de la réduction respiratoire GO avec l'oxydation de l'acétate.

L'enrichissement des GORB a été réalisé en utilisant trois échantillons environnementaux d'eau douce différents comme semence, à savoir l'eau de rivière (RW), le sol de rizière (PS) et les sédiments des canaux d'eau (WC). Ces échantillons ont été incubés avec du GO et de l'acétate pendant plusieurs jours. Ensuite, des portions des cultures ont été transférées dans un milieu frais pour continuer la culture. Par transfert répété et culture de plus de 10 fois, nous avons obtenu des cultures hautement enrichies désignées comme cultures RW, WC et PS.

Au début du processus d'enrichissement, le GO ajouté a été entièrement dispersé dans les cultures, ce qui a donné des suspensions brunes (Fig. 1A). Ensuite, les cultures sont progressivement devenues noires et ont formé un complexe d'hydrogel dense pendant une période d'incubation de 10 jours. Une analyse XPS a montré que le GO dans les trois cultures avait des spectres C1s avec deux pics majeurs respectifs environ à 287 eV pour C = O et 285 eV pour les liaisons CC/CH à 0 d (Fig. 1B). Le pic C = O dominait initialement et diminuait progressivement avec le temps dans toutes les cultures. Pendant ce temps, le pic CC/CH est devenu dominant et le pic C = O a presque disparu. Aucun ou peu de changements d'apparence et le pic XPS ont été observés dans les cultures autoclavées en tant que contrôle (Fig. 1A, B). Ces observations ont indiqué que la réduction de GO telle qu'évaluée par le changement de couleur du brun au noir dépend de l'activité microbienne.

Croissance dépendante de GO et auto-agrégation de cellules microbiennes dans des cultures d'enrichissement.

(A) Apparition des trois cultures d'enrichissement (cultures-RW, -PS, -WC) inoculées avec des cellules autoclavées et intactes, montrant la formation d'un complexe d'hydrogel auto-agrégé. (B) Données XPS de GO et du GO partiellement réduit dans les cultures avec des inocula autoclavés ou intacts après 10 jours. (C) Concentration d'acétate dans les cultures avec et sans GO après 10 jours. (D) Densité cellulaire dans les cultures avec et sans GO et acétate (ACE) après 10 jours.

Dans les trois cultures d'enrichissement, l'acétate a été consommé avec la réduction de GO mais est resté inchangé dans le témoin sans GO (Fig. 1C). La diminution simultanée de l'intensité du pic C = O et de la concentration d'acétate suggère que la réduction de GO est couplée à l'oxydation de l'acétate. Lorsque le complexe d'hydrogel était dispersé dans la phase aqueuse par homogénéisation, la densité cellulaire était environ 20 fois plus élevée dans les cultures modifiées au GO et à l'acétate que dans les cultures sans additif ou les deux, représentant (4, 0–7, 6) × 106 cellules / ml (Fig. 1D). Étant donné que les bactéries actuelles nécessitaient à la fois du GO et de l'acétate pour leur croissance, il est logique de conclure que cette croissance dépend en fait de la respiration anaérobie avec le GO comme accepteur d'électrons terminal et l'acétate comme source de carbone et d'énergie.

Dans les cultures d'enrichissement avec GO, 80 ± 12 % des cellules étaient réparties dans le complexe d'hydrogel développé (tableau 1). L'imagerie SEM du complexe d'hydrogel a révélé que l'inclusion de structures cellulaires bactériennes s'est produite à la surface du complexe (Fig. 2). Les morphotypes de bactéries dans les trois cultures étaient similaires les uns aux autres, car les bâtonnets courbés étaient abondants et des cocci étaient parfois observés. Ces structures cellulaires n'ont pas été observées sur GO lui-même avant l'incubation.

Images MEB de GO et des complexes rGO-GORBs.

(A) Image SEM de GO utilisée dans cette étude. (B – D) Images SEM des complexes rGO-RGOBs en culture-RW (B), -PS (C), -WC (D), respectivement.

Pour identifier les bactéries dans les complexes d'hydrogel noir de rGO et de GORB, les gènes d'ARNr 16S de ces complexes ont été amplifiés par PCR et analysés par séquençage à haut débit avec la plateforme Illumina MiSeq. Dans les trois cultures, les gènes d'ARNr 16S de l'espèce Geobacter, bactérie exoélectrogène bien connue, étaient les plus abondants, représentant 51 à 68% du total des amplicons (Fig. 3). Outre la bactérie Geobacter, des membres d'Azospira ont été détectés de manière significative dans les trois cultures, représentant 28 à 42% de la population totale. Les espèces d'Azospira, qui sont des oxydants d'acétate, ont été fréquemment détectées dans la chambre anodique des MFC27,28.

Identification des bactéries cultivées avec GO.

Les camemberts d'identification phylogénétique des unités taxonomiques opérationnelles (OTU) dans trois cultures (culture-RW, -PS, –WC). Les OTU ayant plus de 1 % de fréquence ont été présentés dans les graphiques.

Comme indiqué ci-dessus, nous avons obtenu avec succès les complexes d'hydrogel rGO-GORB grâce au processus d'enrichissement avec GO et acétate. Pour assurer la capacité de ces complexes à convertir l'acétate en électricité, ils ont été polarisés à +200 mV (vs Ag/AgCl). L'électricité dans les trois complexes a été rapidement générée, le niveau maximal apparaissant dans une plage de 1 000 à 1 300 μA/cm3 les jours 1 à 2 (Fig. 4A). La production d'électricité a diminué progressivement avec le temps mais a été récupérée lors d'un dopage avec de l'acétate. La production immédiate et stable d'électricité était due à une croissance significative et à une activité stable des exoélectrogènes réducteurs de GO dans les complexes après polarisation. Après 10 à 20 jours de polarisation avec la triple addition d'acétate 5,0 mM, le nombre total de cellules dans les trois cultures variait de (3,7 à 4,9) × 109 à (0,53 à 3,8) × 1012 cellules/culture (tableau 1) et 64 à 89 % étaient présents dans les complexes. La densité cellulaire par unité de volume était 160 fois plus élevée (0,5 × 1011 à 3,1 × 1011 cellules/cm3) dans les complexes qu'en phase liquide avec des cellules planctoniques (1,7 × 108 à 5,3 × 108 cellules/mL). Dans tous les complexes, les espèces de Geobacter constituaient une majorité écrasante (77 à 91%) des populations cultivées par voie électrochimique (tableau supplémentaire S1).

Production d'électricité par les complexes rGO-GORBs.

(A) Modifications de l'électricité produite par les complexes rGO-GORBs inoculés avec RW, PS et WC. (B) CV obtenu par les trois complexes rGO-GORBs. (C) EIS obtenu par les trois complexes rGO-GORBs. Les nombres indiqués dans le graphique sont des fréquences : f [Hz] = ω/2π.

Les courbes CV pour les trois complexes rGO-GORB ont montré le courant catalytique d'oxydation de l'acétate, par exemple, 1200–1700 μA/cm3 à 500 mV vs Ag/AgCl avec 0,2 mV/s de vitesse de balayage (Fig. 4B). Aucun pic redox évident n'est apparu. Les voltammogrammes pour les cultures RW et PS ont montré des décharges de courant symétriques gonflées, indiquant que la capacité électrique à double couche dépendait de la grande surface des complexes rGO-GORBs. Dans la culture WC, la courbe CV est devenue biaisée à des potentiels inférieurs. Sur la base du diagramme de Nyquist utilisant les données brutes des trois complexes (Fig. 4C), les résistances au transfert de charge (Rct), exprimées en diamètre des demi-cercles, étaient <1,0 Ω/cm3 dans les cultures RW et PS et 1,0–2,0 Ω/cm3 dans la culture WC. Les deux demi-cercles apparents dans WC indiquaient que deux réactions électrochimiques étaient impliquées. Le demi-cercle plus petit était similaire à ceux observés dans les cultures RW et PS, suggérant qu'une réaction cinétique électrochimique par Geobacter a eu lieu. Le plus grand demi-cercle a peut-être montré l'implication de réactions cinétiques électrochimiques par d'autres bactéries telles que les espèces de Sulfurospirillum certainement cultivées dans WC (13% de la population totale) mais pas ou moins cultivées (<0,1%) dans RW et PS (tableau supplémentaire S1).

Pour déterminer si les bactéries Geobacter enrichies sont réellement capables de se développer par respiration GO, des tentatives pour isoler Geobacter des cultures d'enrichissement ont été faites par culture anaérobie sur gélose avec GO. Comme résultats, la culture RW a donné de petites colonies avec un grand halo noir dans le milieu gélosé comme étant positives pour la réduction GO (Fig. 5A). Une seule colonie de cette plaque de gélose a été purifiée avec succès par dilution répétée de gélose et conçue comme souche R4. Par séquençage du gène de l'ARNr 16S, la souche R4 a été identifiée en fait comme un membre du genre Geobacter avec la souche Geobacter bremensis Df1T (numéro d'accès U96917) comme son parent le plus proche à un niveau de similitude de 99,3 %.

Croissance dépendante de GO et auto-agrégation de Geobacter sp. souche de cellules R4.

(A) Formation de halo noir par la souche R4 dans une plaque de gélose comme étant positive pour la réduction GO. (B) GO réduction et auto-agrégation des cellules dans un complexe d'hydrogel dans les cultures R4 inoculées avec des inoculums intacts (supérieurs) et autoclavés (inférieurs). (C) Données XPS des spectres C1s dans la culture R4 intacte. (D) Concentration d'acétate dans les cultures R4 intactes avec et sans GO. (E) Le nombre de copies du gène ARNr 16S dans les cultures R4 intactes avec et sans GO et acétate (ACE).

Une culture pure de Geobacter sp. la souche R4 était capable de réduire GO et de former un complexe d'hydrogel noir avec rGO (complexe rGO-R4) similaire à celui observé dans la culture RW (Fig. 5B, C). La souche R4 a nécessité 30 jours pour former le complexe rGO-R4, alors qu'il a fallu 10 jours pour former le complexe rGO-RW dans la culture mixte. La croissance anaérobie de la souche R4 s'est produite avec la consommation d'acétate et la réduction de GO (Fig. 5D, E). Dans une analyse XPS de trois échantillons prélevés à différentes positions du complexe au jour 36, les liaisons CC abondantes en tant que pic principal de C1 ont été observées à plusieurs reprises (Figure supplémentaire S2), ce qui suggère que le GO dans le complexe était entièrement réduit. La conductivité électrique du complexe rGO-R4 était de 16 mS/cm, ce qui est beaucoup plus élevé que celui enregistré pour le GO original par réduction microbienne (Figure supplémentaire S3A, B).

Ces résultats montrent que Geobacter sp. la souche R4 est capable de se développer de manière anaérobie par respiration GO sans aucune association avec d'autres micro-organismes et de former un hydrogel conducteur avec rGO.

Le complexe rGO-R4 a été examiné pour sa capacité à produire de l'électricité. À titre de comparaison, le feutre de graphite (GF), une anode représentative largement utilisée dans les MFC, a été utilisé. Dans les deux systèmes complexes, le nombre de cellules présentes était d'environ 8,0 × 108 cellules/complexe. Les cellules de la souche R4 produisaient de l'électricité dans les deux complexes à 1 300–1 700 μA / cm3 en 7 jours, mais présentaient des profils de production différents en fonction des anodes utilisées (Fig. 6A). L'électricité dans le complexe GF-R4 a été progressivement réduite avec le temps et n'a pas été récupérée par dopage avec de l'acétate, tandis que l'électricité dans le complexe rGO-R4 a été générée de manière stable. Ces résultats ont été hautement reproduits dans des essais répétés, comme le montre la Fig. S2 supplémentaire. La concentration d'acétate dans la culture rGO-R4 est devenue inférieure à la limite de détection après 20 jours d'incubation. D'autre part, plus de la moitié de l'acétate ajouté (8,0 mM) restait encore dans la culture GF-R4 (Figure supplémentaire S4). Ces résultats indiquent que la culture rGO-R4 peut oxyder l'acétate et générer de l'électricité beaucoup plus efficacement que la culture GF-R4.

Production d'électricité par Geobacter sp. souche R4 en utilisant du GO et du feutre de graphite comme anode.

(A) Changements d'électricité dans les complexes rGO-R4 (vert) et GF-R4 (violet). (B) Apparition des complexes rGO-R4 et GF-R4 après 30 jours d'incubation. (C) Image SEM des complexes rGO-R4 et GF-R4 après 30 jours d'incubation. (D) Courbes CV obtenues par les complexes rGO-R4 et GF-R4. (E) Données EIS obtenues par les complexes rGO-R4 et GF-R4. L'encart montre les mêmes données agrandies dans une plage étroite. Les nombres indiqués dans le graphique sont des fréquences : f [Hz] = ω/2π.

Les complexes rGO-R4 sont devenus rosâtres après une semaine de polarisation (Fig. 6B). Cette coloration dépendante du temps était similaire à celle observée généralement dans le biofilm multicouche de Geobacter. La densité des cellules dans le complexe rGO-R4 est passée de 8,0 × 108 cellules/cm3 à 3,6 × 1010 cellules/cm3, représentant 93 % de la population totale dans l'ensemble de la culture (tableau 2). L'observation SEM a indiqué que la surface du complexe rGO-R4 était en effet recouverte de cellules abondantes (Fig. 6C). L'ensemble de ces résultats suggère la formation d'un biofilm multicouche sur le complexe rGO-R4 par polarisation électrique. En revanche, dans la culture GF-R4, aucun biofilm apparent ne s'est développé mais une phase liquide trouble rose s'est formée (Fig. 6B). La masse totale de cellules dans la culture GF-R4 n'était pas supérieure à 6,4 % de celle de la culture rGO-R4 (tableau 2) et 64 % des cellules étaient planctoniques. Ce niveau inférieur de biomasse pourrait être lié aux profils électrochimiques et physiologiques dans la culture GF-R4.

Pour évaluer l'effet de la structure hydrogel du complexe rGO-R4 sur la production d'électricité, la souche R4 a été cultivée électriquement à l'aide de graphite revêtu avec ou sans GO (Figures supplémentaires S5 et S6). Dans les deux cultures, la souche R4 a formé des biofilms à la surface du graphite (tableau supplémentaire S3) et a produit de l'électricité. Contrairement au cas du complexe d'hydrogel, cependant, la production d'électricité dans les deux cultures a diminué progressivement avec le temps. Ces résultats indiquent que la structure hydrogel est importante pour maintenir la production d'électricité par la souche R4.

L'analyse CV du complexe rGO-R4 après polarisation a montré un courant catalytique beaucoup plus élevé (1 300 μA/cm3) dans le complexe rGO-R4 à 500 mV (vs Ag/AgCl) que dans le complexe GF-R4 (470 μA/cm3) (Fig. 6D). La plus grande production d'électricité avec rGO était probablement due à une capacité plus grande et à une résistance beaucoup plus faible que celles notées avec GF (Fig. 6E). Les données EIS ont clairement montré un Rct 10 fois plus petit dans le rGO-R4 que dans le complexe GF-R4, c'est-à-dire <1,0 Ω/cm3 et >10 Ω/cm3, respectivement. Dans les réactions cinétiques électrochimiques idéales, la capacité (C) est inversement proportionnelle à Rct et la fréquence angulaire (ωmax) montrant le sommet du demi-cercle (ωmaxCRct = 1). Par conséquent, la capacité de rGO-R4 peut être estimée supérieure à celle de GF-R4.

Une meilleure performance du complexe rGO-R4 a également été observée avant même la polarisation électrique (Figure supplémentaire S7). Les résultats ont clairement indiqué que le complexe rGO-R4 avait à l'origine une capacité électrique à double couche et une faible résistance au transfert de charge avant la formation du biofilm. Le biofilm formé sur le complexe après polarisation a montré 0,46 mS/cm de conductivité électrique, ce qui est bien inférieur à la valeur du complexe rGO (16 mS/cm). Ces résultats ont indiqué que la plus grande capacité électrique et la plus petite résistance au transfert de charge provenaient du complexe d'hydrogel lui-même plutôt que du biofilm sur le complexe, bien que potentiellement soutenus en partie par le biofilm.

Bien que le GO soit un nanomatériau très prometteur dans son application aux BES, il a été contesté en raison de ses effets sur la croissance bactérienne et le métabolisme. Au cours de la dernière décennie, un certain nombre d'études ont montré que le GO avait des effets antibactériens ou bactéricides sur une grande variété d'espèces22,23,29,30. Ainsi, l'objectif principal de cette étude était de déterminer si GO fonctionne comme accepteur d'électrons terminal pour soutenir la croissance des bactéries exoélectrogènes et notre tentative pour le démontrer a été couronnée de succès. La croissance dépendante de GO a permis un enrichissement sélectif des bactéries exoélectrogènes dans le complexe (Figs 1 et 3). L'utilisation de ce procédé présente un plus grand avantage pour réduire le GO que les autres techniques de réduction du GO abiotique. Les résultats incohérents des études précédentes montrant une activité antibactérienne et les nôtres proviennent probablement de différences dans les conditions expérimentales avec GO mis en place. Des articles récents ont indiqué que l'activité antibactérienne du GO n'est détectable que sur la surface recouverte de GO de petite taille mais pas dans la solution aqueuse31,32. Par conséquent, la croissance des bactéries exoélectrogènes que nous avons trouvées peut être induite par l'état non cytotoxique de GO en solution aqueuse31.

L'une des observations les plus frappantes de cette étude est que la culture d'échantillons environnementaux a entraîné la formation de complexes d'hydrogel auto-agrégés de bactéries exoélectrogènes et de rGO qui peuvent fonctionner comme conducteur. Le mécanisme de cette formation d'hydrogel est inconnu avec certitude, mais cela est peut-être causé par un empilement partiel π-π du rGO, comme observé précédemment dans la réduction hydrothermique du GO en hydrogel rGO24. Par conséquent, la formation d'hydrogel rGO dépend probablement de la capacité bactérienne à réduire le GO. Lorsque les espèces Shewanella 17, 18 et Escherichia coli 19 ont été cultivées avec GO, le rGO résultant était présent sous forme de flocs mais pas sous forme de complexe hydrogel. Néanmoins, ces espèces bactériennes peuvent former l'hydrogel rGO dans les mêmes conditions de culture que celles utilisées dans cette étude. Ainsi, la présente étude fournit un nouveau modèle de bioconducteurs en tant qu'assemblage à haute densité de rGO et de bactéries.

Comme indiqué ici, les populations de Geobacter enrichies en GO de l'environnement dans les complexes d'hydrogel sont beaucoup plus élevées que celles détectées dans des environnements naturels tels que le sol de rizière33, les sédiments de zones humides34 et les sédiments d'aquifère35. Il convient également de noter que les complexes rGO-GORBs comprenaient des populations de Geobacter plus élevées que les MFC alimentés avec de l'acétate, où Geobacter constituait 14 à 60 % de la population totale36,37,38,39. Cela suggère que la culture à l'aide de GO est plus utile pour l'enrichissement sélectif de Geobacter et d'autres bactéries motrices EET par rapport au système conventionnel sous polarisation électrique. Outre les espèces de Geobacter, des membres d'Azospira ont été détectés dans des proportions significatives (28 à 41 % au total) dans les cultures d'enrichissement. Bien que les espèces d'Azospira aient été fréquemment détectées dans les MFC27,28, aucune d'entre elles n'a été rapportée comme réduisant les accepteurs d'électrons extracellulaires. L'une des caractéristiques des bactéries motrices d'EET, telles que les espèces Geobacter et Shewanella40, est la capacité d'oxyder les substances humiques et de même, une souche d'Azospira a été signalée comme oxydant les substances humiques41. Sur la base de ces résultats collectifs, on peut supposer que les bactéries Azospira dans les complexes rGO-GORBs sont impliquées dans la réduction des GO. En culture WC, la proportion de Sulfurospirillum est passée de 6,1% à 13% par polarisation. Compte tenu de cela, ainsi que du fait que les membres de Sulfurospirillum sont capables d'EET aux oxydes de fer42, ces bactéries peuvent jouer un rôle dans la production d'électricité dans le complexe rGO-GORBs.

Geobacter sp. la souche R4, une bactérie nouvellement isolée dans cette étude, a présenté une croissance de biofilm et une production d'électricité stable avec rGO tout en montrant une croissance planctonique et une production d'électricité temporaire avec GF (Fig. 6). Cette différence dans les caractéristiques bioélectrochimiques entre les deux cultures suggère que la souche R4 modifie le mode de EET en fonction des matériaux carbonés, c'est-à-dire EET direct vers rGO et EET indirect vers GF via des molécules redox aqueuses. Il a été démontré que, chez les espèces de Geobacter exoélectrogènes, les EET directs sont catalysés par des protéines de la membrane externe, notamment des cytochromes de type c et des biofilaments conducteurs. La croissance des cellules planctoniques de Shewanella oneidensis43 sous polarisation est associée à la production de navettes électroniques telles que les flavines44. Il est à noter que la commutation dépendante des électrodes du mode EET par une culture pure a été découverte pour la première fois dans cette étude. Les caractéristiques uniques de Geobacter sp. la souche R4 fournira un nouvel aperçu de la compréhension globale de l'interaction des bactéries exoélectrogènes avec l'électrode de carbone.

À notre connaissance, cette étude est la première à démontrer la croissance sélective GO-dépendante de bactéries exoélectrogènes et la formation d'un complexe hydrogel auto-agrégé de la biomasse et du rGO. Le complexe rGO-GORB a une meilleure croissance du biofilm, une résistance interne beaucoup plus faible et une capacité plus grande que le système utilisé par GF. Le simple processus de mise en attente conduisant à l'auto-agrégation dans le complexe rGO-biomasse et l'amélioration de l'EET entre les bactéries et l'électrode contribuera à l'expansion de l'application de GO dans les BES.

La poudre GO a été achetée auprès de Royal Elite New Energy Science & Technology Co., Ltd (Shanghai, Chine). GO a été dissous dans de l'eau MilliQ stérilisée pour donner une concentration de 10 g / L, soniqué pendant plus de 2 h à l'aide d'un sonicateur Bransonic modèle CPX (Branson Ultrasonics, Emerson Japan, Ltd., Atsugi, Japon) et stocké à 4 ° C jusqu'à utilisation. Le GO ainsi préparé a été analysé pour l'épaisseur et la surface des flocons avec un microscope à force atomique Agilent PicoPlus 5500 (Agilent Tech. Inc., Santa Clara, CA).

Les états chimiques du GO et du GO biologiquement réduit (rGO) ont été analysés par spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS). Pour cette analyse, le GO et le rGO ont été déposés et séchés sur une tranche de silicium. Les tranches de silicium ont été collectées, lavées plusieurs fois avec de l'eau MilliQ et séchées comme décrit précédemment17. Les spectres XPS ont été mesurés à l'aide d'un instrument XPS, Versa Probe PHI-5000 (ULVAC-PHI Inc., Osaka, Japon) équipé d'une source de rayons X Al Ka ​​monochromatique et fonctionnant à une pression nue inférieure à 10−6 Pa. Le spectre de niveau central des C1 a été obtenu par des balayages focalisés après un balayage d'enquête sur 0–1 100 eV.

Les GORB ont été enrichis par culture anaérobie d'échantillons environnementaux en utilisant un milieu chimiquement défini avec de l'acétate comme source de carbone et d'énergie et GO comme accepteur d'électrons. Comme graine, nous avons utilisé trois échantillons environnementaux différents, à savoir l'eau de rivière (conçue RW, 34°42′22″N, 137°23′31″E), les sédiments dans un canal d'eau (conçu WC, 34°42′26″N, 137°23′42″E) et un sol de rizière (conçu PS, 34°42′37″ Nord, 137°23′47″E). Les trois cultures RW, WC et PS ont été incubées indépendamment et transférées séquentiellement dans du milieu frais périodiquement comme décrit dans les informations complémentaires. Après l'enrichissement, les GORB des cultures d'enrichissement ont été isolées par la technique de dilution en gélose comme décrit dans les informations complémentaires.

Les GORB enrichies et isolées ont été identifiées phylogénétiquement par séquençage des gènes d'ARNr 16S. Les gènes d'ARNr 16S des cultures d'enrichissement ont été amplifiés par PCR avec l'ADN en vrac comme matrice et séquencés à l'aide du système Illumina MiSeq, comme décrit dans les informations complémentaires. Un isolat de GORB provenant de la culture d'enrichissement a été soumis à une amplification par PCR du gène d'ARNr 16S à l'aide des amorces 27f et 1492r (supportant le tableau 1). L'amplicon du gène de l'ARNr 16S a été séquencé à l'aide d'un kit Applied Biosystems Big Dye Terminator V3.1 (Life Technologies, Carlsbad, CA) et d'un analyseur d'ADN Applied Biosystems 3730xl (Life Technologies) comme décrit précédemment45.

Pour la quantification de l'acétate dans la culture, une partie de la culture a été prélevée et analysée à l'aide d'un système HPLC en phase inverse (Shimadzu, Kyoto, Japon) équipé d'ODS L-column2 (4,6 × 250 mm) (CERI, Tokyo, Japon) et d'un détecteur UV comme décrit précédemment46. Les numérations cellulaires totales directes dans les cultures d'enrichissement, RW, PS et WC ont été déterminées par microscopie à épifluorescence avec coloration SYBR GREEN II47. Pour surveiller la croissance cellulaire dans une culture pure de la souche R4, une qPCR en temps réel a été réalisée en utilisant un ensemble d'amorces universelles pour les gènes bactériens d'ARNr 16S, 357f et 517r (tableau supplémentaire S2). La qPCR a été réalisée avec un kit LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) et le système LightCycler Nano (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) comme décrit précédemment45. Comme standard, l'amplicon du gène de l'ARNr 16S purifié de l'ADN génomique de la souche R4 a été utilisé.

Pour les essais de production d'électricité microbienne dans les complexes rGO-GORBs, des cultures enrichies et pures de GORBs ont été incubées dans une bouteille en verre d'une capacité de 0,93 L (taille, diamètre 90 mm et hauteur 175 mm) avec les modifications mineures suivantes. Pour le complexe ensemencé avec des cultures d'enrichissement, 1 L de milieu minéral anaérobie dénommé AGOFS a été préparé dans un flacon en verre de 2 L et autoclavé (voir informations complémentaires). Pour le complexe rGO-R4, le milieu AGOSF a également été préparé. Après autoclavage, le milieu a été mélangé avec 0,67 g/L de GO et 15 mL de la pré-culture et versé dans une bouteille en verre pour éliminer l'espace de tête. La bouteille en verre a ensuite été incubée à 28°C pendant 1 mois. Après incubation, un complexe d'hydrogel d'environ 30 mm de diamètre et de 10 à 20 mm de hauteur a été obtenu.

Pour l'imagerie SEM, le complexe rGO-GORBs a été fixé avec 2 % de glutaraldéhyde et 1 % de tétroxyde d'osmium, comme décrit dans les informations complémentaires. Les échantillons préparés ont été recouverts d'or par pulvérisation, puis observés sous un microscope électronique à balayage à émission de champ SU8000 (Hitachi Co., Ltd., Tokyo, Japon) fonctionnant à 1,0 kV.

Pour la culture électrochimique, une bouteille en verre stérilisée d'une capacité de 0,93 L (90 mm de diamètre et 175 mm de hauteur) reliée à un fil de platine comme électrode de travail a été utilisée. Le flacon a été rempli de milieu AGOS (voir informations complémentaires) auquel ont été ajoutés les complexes rGO-GORB. A titre de comparaison, du GF de 30 mm de diamètre et de 20 mm d'épaisseur a été utilisé comme anode MFC représentative. Le GF a été immergé dans la suspension cellulaire de R4 et les cellules contenant le GF ont été utilisées comme complexe GF-R4. Une électrode Ag/AgCl (sel de KCl) et un autre fil de platine ont été utilisés respectivement comme électrode de référence et contre-électrode. La polarisation a été réalisée en réglant le potentiel de l'électrode de travail à +200 mV par rapport à Ag/AgCl en utilisant un potentiostat HA-1510 (Hokuto Denko, Tokyo, Japon). Pendant la polarisation, le courant a été enregistré toutes les 60 minutes à l'aide d'un enregistreur de données (T&D Corporation, Nagano, Japon).

L'analyse par voltamétrie cyclique (CV) et la spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS) des complexes rGO-GORB ont été réalisées à l'aide d'un système de mesure électrochimique HZ-7000 (Hokuto Denko, Tokyo, Japon). Les analyses CV et EIS ont été effectuées en utilisant la même bouteille que celle utilisée pour la culture électrochimique décrite ci-dessus après 2 h de stabilisation avec de l'acétate 5,0 mM. Le CV a été réalisé à une vitesse de balayage de 0,2 mV/s, dans la plage de potentiel de -400 à 600 mV (vs Ag/AgCl). L'EIS a été examiné pour les complexes rGO-GORB dans une gamme de fréquences de 100 kHz à 0, 5 mHz à 200 mV avec une amplitude de 20 mV pour le signal alternatif appliqué. Les parcelles de Nyquist ont été analysées à l'aide d'un logiciel d'analyse de données EIS ZSimpWin (Princeton Applied Research, Oak Ridge, TN). Les analyses CV et EIS ont été effectuées à 10 jours de polarisation pour les complexes des cultures RW et PS tandis qu'à 20 jours pour le complexe de la culture WC. Pour les complexes avec la souche R4, des données ont été obtenues à 7 jours et 12 jours de polarisation à partir des complexes rGO et GF de run2 (Fig. S2 supplémentaire).

La séquence du gène de l'ARNr 16S de la souche R4 déterminée dans cette étude a été déposée sous le numéro d'accès DDBJ LC076693 (http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html). Un ensemble compilé des séquences Illumina MiSeq a été déposé dans la base de données Short Read Archive sous le numéro d'accession DRA003954.

Comment citer cet article : Yoshida, N. et al. Croissance et auto-agrégation dépendantes de l'oxyde de graphène dans un complexe hydrogel de bactéries exoélectrogènes. Sci. Rep. 6, 21867; doi : 10.1038/srep21867 (2016).

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Cette étude a reçu un financement de la JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (numéro de subvention : 26701010) ; le Programme de diffusion du système de suivi des tenures, MEXT, Japon ; et le JST Accelerating Utilization of University IP Program.

Centre pour la promotion de jeunes chercheurs innovants, Nagoya Institute of Technology, Nagoya, Aichi, 466-8555, Japon

Naoko Yoshida

Institut de recherche interdisciplinaire inspiré de l'électronique (EIIRIS), Université de technologie de Toyohashi, Toyohashi, 441-8580, Aichi, Japon

Naoko Yoshida, Yuko Goto, Ryugo Tero et Akira Hiraishi

Institut municipal de recherche industrielle de Nagoya, Nagoya, 456-0058, Aichi, Japon

Yasushi Miyata

Département de génie civil, Institut de technologie de Nagoya, Nagoya, 466-8555, Aichi, Japon

Kasumi Doi

Département des sciences biomédicales, Collège des sciences de la vie et de la santé, Université Chubu, Kasugai, 487-8501, Aichi, Japon

Yuko Goto

Département des sciences de l'environnement et de la vie, Université de technologie de Toyohashi, Toyohashi, 441-8580, Aichi, Japon

Yuji Nagao, Ryugo Tero et Akira Hiraishi

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NY a conçu l'étude, rédigé le manuscrit et mené des expériences d'enrichissement, de préparation du complexe rGO-GORB et de culture électrochimique. YN et YG ont participé à des expériences d'enrichissement. KD a participé à la culture électrochimique de la souche R4. RT a effectué une analyse de GO et de rGO et a participé à la révision du manuscrit. YM a mené des expériences CV et EIS. AH a participé à l'interprétation des données et a révisé le manuscrit.

Il y a des intérêts financiers concurrents. Nous déposons actuellement des demandes de brevets sur les méthodes décrites dans l'article.

Ce travail est sous licence internationale Creative Commons Attribution 4.0. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans la ligne de crédit ; si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons, les utilisateurs devront obtenir l'autorisation du titulaire de la licence pour reproduire le matériel. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Réimpressions et autorisations

Yoshida, N., Miyata, Y., Doi, K. et al. Croissance et auto-agrégation dépendantes de l'oxyde de graphène dans un complexe hydrogel de bactéries exoélectrogènes. Sci Rep 6, 21867 (2016). https://doi.org/10.1038/srep21867

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Reçu : 09 octobre 2015

Accepté : 02 février 2016

Publié: 22 février 2016

DOI : https://doi.org/10.1038/srep21867

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