La résistance à l'ivosidenib, inhibiteur mutant de l'isocitrate déshydrogénase 1, peut être surmontée par un autre dimère

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 4785 (2022) Citer cet article

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L'ivosidenib, un inhibiteur des variants de l'isocitrate déshydrogénase 1 (IDH1) R132C et R132H, est approuvé pour le traitement de la leucémie myéloïde aiguë (LMA). Une résistance à l'ivosidenib due à une seconde mutation du site de IDH1 R132C, conduisant à IDH1 R132C/S280F, est apparue. Nous décrivons des études biochimiques, cristallographiques et cellulaires sur les variants IDH1 R132C/S280F et R132H/S280F qui renseignent sur le mécanisme de résistance au second site, qui implique à la fois la modulation de la liaison de l'inhibiteur à l'interface dimère IDH1 et l'altération des propriétés cinétiques, qui permettent une production plus efficace de 2-HG par rapport à IDH1 R132C et IDH1 R132H. Il est important de noter que les résultats biochimiques et cellulaires démontrent qu'il devrait être possible de surmonter la résistance médiée par le S280F chez les patients atteints de LAM en utilisant des inhibiteurs alternatifs, dont certains sont actuellement en phase 2 d'essais cliniques.

On sait depuis longtemps que les cellules cancéreuses ont le potentiel d'altérer leur métabolisme1, mais ce n'est que récemment que cette connaissance a été exploitée à des fins thérapeutiques1,2,3. Chez l'homme, il existe trois isoformes d'isocitrate déshydrogénase (IDH1-3), qui catalysent la conversion de l'isocitrate en 2-oxoglutarate (2-OG); IDH1/2 utilise NADP+ comme cofacteur, tandis que IDH3, qui fait partie du cycle de l'acide tricarboxylique (TCA), utilise NAD+4,5. Diverses mutations somatiques des gènes codant pour l'isocitrate déshydrogénase 1 (IDH1) et 2 (IDH2) conduisent à des variants avec une capacité considérablement accrue à catalyser la réduction de 2-OG en 2-hydroxyglutarate (2-HG)6,7,8,9. Par conséquent, des niveaux élevés de 2-HG sont proposés pour favoriser la tumorigenèse, potentiellement via la déstabilisation de la chromatine10. Les variants IDH1 les plus courants dans les cellules cancéreuses sont R132H et R132C11.

Plusieurs inhibiteurs d'IDH1 et d'IDH2 sont signalés, bien qu'un seul inhibiteur d'IDH1 (ivosidenib) et un seul inhibiteur d'IDH2 (enasidenib) aient été approuvés pour une utilisation clinique, c'est-à-dire pour le traitement de la leucémie myéloïde aiguë (LAM) où les cellules cancéreuses fabriquent une variante d'IDH12,13. Cependant, la résistance à l'ivosidenib est apparue à la suite d'une mutation de second site qui produit IDH1 R132C/S280F, 5 cas ayant été signalés à ce jour14,15,16.

La base mécaniste précise par laquelle la seconde substitution IDH1 S280F permet la résistance à l'ivosidenib et ses conséquences pour l'inhibition de la variante IDH1 au-delà de celle de l'ivosidenib n'ont pas été claires14,15,16. Nous rapportons des études biochimiques, structurelles et cellulaires sur IDH1 R132C/S280F et IDH1 R132H/S280F qui répondent à ces questions. Les résultats avec des enzymes isolées informent sur le mécanisme de la résistance médiée par S280F, qui implique une liaison réduite de l'inhibiteur à l'interface dimère et une altération des propriétés cinétiques, permettant une production accrue de 2-HG par rapport à IDH1 R132C ou R132H. Fait important, les résultats révèlent que la substitution S280F entraîne une résistance à l'ivosidenib, mais ce n'est pas le cas avec plusieurs autres inhibiteurs IDH1 R132H et R132C, dont certains sont en essais cliniques de phase 2.

Pour étudier le mécanisme de la résistance aux inhibiteurs médiés par IDH1 S280F, nous avons utilisé des protocoles établis17,18 pour produire des formes hautement purifiées d'IDH1 R132C/S280F et R132H/S280F recombinants et, à titre de comparaison, IDH1 R132C, IDH1 R132H, IDH1 de type sauvage (wt), IDH1 S280F (sans IDH1 R132C ou R132H) et IDH1 R132H/Q277E (Fig. 1a supplémentaire). Le variant IDH1 R132H/Q277E a été fabriqué parce que la résistance acquise aux médicaments contre l'énasidénib inhibiteur du mutant IDH2 a été liée à (i) IDH2 R140Q/I319M et (ii) IDH2 R140Q/Q316E ; IDH2 I319 est homologue à IDH1 S280 et IDH2 Q316 est homologue à IDH1 Q277 (Fig. 1b/c supplémentaire)14. Conformément aux études antérieures sur IDH1 R132H et R132C, toutes les protéines recombinantes étaient principalement dimères en solution (Fig. 1d – f supplémentaires) et probablement co-purifiées avec deux molécules de NADPH (comme indiqué pour IDH1 wt et R132H18, et illustré pour IDH1 R132C, Fig. 1g/h supplémentaire). Alors que des études biophysiques montrent que la substitution S280F n'affecte pas la structure secondaire (Fig. 1i supplémentaire), cette substitution améliore considérablement la stabilité thermodynamique des variants IDH1 R132C et R132H, ainsi que IDH1 wt (Fig. 1b; Fig. 1j supplémentaire). Notez que dans le texte suivant, toutes les variantes IDH auxquelles il est fait référence sont basées sur IDH1, sauf indication contraire.

une variante IDH1 a catalysé l'oxydation de l'isocitrate et la réduction du 2-OG en 2-HG. b Paramètres cinétiques pour les variants IDH1 (400 nM) à partir d'ajustements de courbe de régression non linéaire (erreur standard de la moyenne, n = 3). Conditions : Tris 100 mM, MgCl2 10 mM, DTT 0,2 mM, Tween 20 0,005 % v/v et BSA 0,1 mg/mL (pH 8,0). Grisé : températures de fusion (Tms) des variants IDH1 mesurées par fluorimétrie différentielle à balayage (DSF, enzyme 3 µM) ou dichroïsme circulaire (CD, enzyme 0,2 mg/mL) ; À : 215 nm. Conditions : DSF (Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4) ; CD (phosphate de sodium 10 mM, pH 8,0). Voir les informations supplémentaires pour plus de détails. c Formation de 2-HG à partir de 2-OG catalysée par des variants IDH1 telle que mesurée par RMN 1H (700 MHz ; barres d'erreur : erreurs standard de la moyenne, n = 3 répliques indépendantes d'expériences sur le cours du temps 1H). Conditions : enzyme 500 nM, MgCl2 10 mM, 2-OG 1,5 mM, NADPH 1,5 mM ; temps d'incubation : 12 min. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. d Formation de 2-HG à partir d'isocitrate catalysée par des variants IDH1, telle que mesurée par RMN (700 MHz ; erreur standard de la moyenne, n = 3 répétitions indépendantes d'expériences de décours temporel 1H). Conditions : enzyme 750 nM, MgCl2 10 mM, DL-isocitrate 3 mM, NADP+ 1,5 mM ; temps d'incubation : 9 min. Tampon : Tris-dll 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM et D2O 10 %, pH 7,5. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Nous avons analysé les activités catalytiques des variantes R132C/S280F et R132H/S280F, en utilisant la RMN 1H pour mesurer la réduction de 2-OG en 2-HG et le renouvellement en deux étapes de l'isocitrate en 2-HG (Fig. 1a/c/d ; Fig. 2a/b supplémentaire). En raison de la nature globale redox-neutre des deux réactions impliquées dans la conversion de l'isocitrate en 2-HG, cette conversion ne peut pas être facilement surveillée par les mesures de NADP+/NADPH18. Comme prévu, les résultats de RMN montrent que le D-isocitrate est un substrat pour R132C/S280F et R132H/S280F (Fig. 2c supplémentaire). Notamment, ils révèlent que le R132C/S280F et le R132H/S280F catalysent la conversion de l'isocitrate en 2-HG et du 2-OG en 2-HG plus efficacement que le R132C ou le R132H, respectivement. (Fig. 1c/d)

Les analyses cinétiques avec R132C / S280F et R132H / S280F surveillant la consommation de NADPH par spectroscopie UV (Fig. 1b) ont démontré que la substitution S280F augmente l'efficacité catalytique (mesurée par kcat / KM) pour la conversion 2-OG en 2-HG, par rapport aux analogues R132C et R132H variantes, avec des valeurs de KM réduites pour le 2-OG et le Mg2 +. Contrairement à ces variants, le variant R132H/Q277E, qui est majoritairement dimérique, et qui a une structure secondaire similaire par rapport aux autres variants IDH étudiés (Fig. 1d – f, i supplémentaires), était inactif par les tests RMN 1H (Fig. 2d/e supplémentaire) et est moins stable que le R132H (Fig. 1j supplémentaire ; Fig. 1b). Des études de fluorimétrie différentielle à balayage (DSF) utilisant la N-oxalylglycine (NOG) comme analogue de 2-OG catalytiquement inactif19,20 et l'isocitrate (avec 10 mM Mg2+), indiquent que R132H/Q277E ne se lie pas, au moins efficacement, au NOG ou à l'isocitrate, reflétant probablement son inactivité (Fig. 2f supplémentaire).

Les analyses cinétiques mesurant la consommation de NADP + pour le variant S280F (sans les substitutions R132C ou R132H) pour la conversion de l'isocitrate en 2-OG (tableau supplémentaire 1a) montrent une efficacité accrue (kcat/KM) par rapport à IDH1 wt en raison d'une diminution de KM pour l'isocitrate ; il n'y a pas eu de changement dans le KM apparent pour Mg2+. Cependant, avec la variante IDH1 S280F, les valeurs KM pour 2-OG et Mg2+ (100 fois) ont toutes deux diminué pour la conversion de 2-OG en 2-HG (tableau supplémentaire 1b), tandis que le kcat a été diminué de 10 fois par rapport à IDH1 wt. Les résultats cinétiques pour les conversions d'isocitrate et de 2-OG mesurés par le renouvellement du NADP + ou du NADPH sont globalement cohérents avec les tests de renouvellement de la RMN 1H (Fig. 3a – f supplémentaires). Les résultats montrant que la substitution S280F diminue les valeurs de KM pour les deux substrats et Mg2+ (en dehors de la conversion de l'isocitrate en 2-OG catalysée par IDH1 S280F) sont remarquables car des travaux récents ont montré que la liaison allostérique dimère-interface des inhibiteurs de la variante IDH1 entrave à la fois Mg2+ et la liaison au substrat18.

Pour étudier plus en détail les conséquences mécanistes de la substitution S280F, nous avons étudié les variants IDH1 à l'aide de la voltampérométrie cyclique (Fig. 3g – l supplémentaire), qui peut mesurer les taux dans chaque direction de cycle NADP (H) et qui peut distinguer la conversion de l'isocitrate en 2-OG de la réduction de 2-OG en 2-HG17. Les résultats impliquent que R132C et R132C/S280F catalysent la conversion de l'isocitrate en 2-OG avec une efficacité similaire (Fig. 3g/h supplémentaire). Cependant, l'efficacité de la conversion globale de l'isocitrate en 2-HG est améliorée pour le R132C/S280F par rapport au R132C (Fig. 1d), le taux de conversion du 2-OG en 2-HG étant approximativement doublé par rapport à IDH1 R132C (Fig. 3g/h supplémentaire). Les résultats de la voltamétrie cyclique montrent que par rapport au R132H, le R132H/S280F affiche une efficacité accrue (environ deux fois), à la fois pour la conversion de l'isocitrate en 2-OG et du 2-OG en 2-HG (Fig. 3i/j supplémentaire). IDH1 S280F (sans R132C ni R132H) affiche une vitesse de réaction multipliée par deux par rapport à IDH1 wt pour la conversion de l'isocitrate en 2-OG (Fig. 3k/l supplémentaire).

Dans l'ensemble, bien que les trois tests de renouvellement mesurant l'absorbance du NADPH, les résonances 1H RMN ou les paramètres de voltamétrie cyclique aient utilisé des conditions différentes, ils montrent tous que la substitution S280F améliore l'efficacité des variantes R132C et R132H dans la conversion de l'isocitrate en 2-HG, principalement en augmentant le taux de réduction du 2-OG en 2-HG.

Des études antérieures ont montré que la plupart des inhibiteurs de variantes d'IDH, y compris probablement l'ivosidenib (il n'y a pas de structure cristalline rapportée pour l'ivosidenib complexé à une variante d'IDH1), se lient à l'interface dimère IDH1/IDH221,22,23,24,25,26. Nous avons récemment montré que la perturbation médiée par les inhibiteurs de la liaison de Mg2+ se produit d'une manière qui affecte de manière disproportionnée la conversion de 2-OG en 2-HG, par rapport à la réaction de type sauvage de l'isocitrate en 2-OG18. Conformément aux résultats antérieurs utilisant NOG et isocitrate, les analyses DSF impliquent que Mg2 + est nécessaire pour une liaison efficace de l'isocitrate et du 2-OG au R132C, R132C / S280F, R132H et R132H / S280F (Fig. 3m / n supplémentaire). Il est possible que la substitution S280F augmente l'affinité de la liaison Mg2+, au moins pour la conversion catalysée par R132C/R132H de 2-OG en 2-HG.

Nous avons ensuite étudié l'inhibition de R132C, R132C/S280F, R132H, R132H/S280F isolés par l'ivosidenib (Fig. 2a ; Fig. 4a supplémentaire). Les analyses RMN et MS démontrent toutes deux que la substitution S280F réduit l'efficacité de liaison de l'ivosidenib (Fig. 2b) et que la stoechiométrie de la liaison de l'ivosidenib est d'une molécule inhibitrice par dimère (Fig. 2c) ; ces observations sont cohérentes avec les travaux antérieurs sur l'inhibition de IDH1 wt et R132H par ivosidenib18. Il a été proposé, sur la base d'études de modélisation15,16, que la résistance à l'ivosidenib est médiée par un obstacle à la liaison de l'inhibiteur en raison de la substitution de S280 par une phénylalanine plus stériquement exigeante (S280F), et que la liaison de l'ivosidenib est en outre entravée par la perte d'une liaison hydrogène à la chaîne latérale alcool de S28016. Pour déterminer si la résistance est uniquement médiée par l'encombrement stérique ou si d'autres facteurs sont impliqués, y compris ceux liés à une perte potentielle d'une liaison hydrogène avec S280, nous avons produit R132C/S280A. L'ivosidenib n'inhibe pas (du moins efficacement) R132C/S280F ou R132H/S280F (Fig. 2a), mais inhibe R132C/S280A avec une IC50 de 992 nM, par rapport à IC50 de 2,5 nM pour R132C (Fig. 4b supplémentaire). Cette observation suggère que l'encombrement stérique par la chaîne latérale de la phénylalanine et la perte d'une liaison hydrogène avec S280 peuvent tous deux contribuer à la résistance à l'ivosidenib (R132C/S280A est moins puissamment inhibé que R132C alors qu'il n'y a pas d'inhibition de R132C/S280F) (Fig. 2a ; Fig. 4b supplémentaire). Cette proposition est cohérente avec les études de liaison des inhibiteurs utilisant la MS non dénaturante et la RMN CPMG (Fig. 2b), qui montrent une diminution de l'affinité du R132C/S280A pour l'ivosidenib par rapport au R132C, mais que la diminution est plus importante pour le R132C/S280F (Fig. 2b).

a Inhibition (%) des variants IDH1 (400 nM) par l'ivosidenib (10 µM) telle que déterminée par le test d'absorbance NADPH. Erreurs : erreurs standard de la moyenne (n = 3 réplicats indépendants mesurés sur la même plaque 96 puits). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. b KD déterminés par MS non dénaturante (enzyme 20 µM, erreurs techniques : n = 3 pour les états de charge z = 19, 20, 21) et en utilisant la séquence RMN pulsée du projet CPMG (enzyme 10 µM, n = 2). SM non dénaturant : tampon citrate d'ammonium (200 mM, pH 7,5) ; RMN CPMG : Tris-dll 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM et D2O 10 %, pH 7,5. c Analyse MS non dénaturante mesurant la liaison de l'ivosidenib aux variants IDH1. À 20 µM, les variants IDH1 sont principalement dimères avec 2 molécules NADP(H) liées - ligne pointillée. Le fond vert correspond à la liaison d'une molécule d'ivosidenib. Concentrations finales d'ivosidenib : 5 µM (4 :1), 20 µM (1 :1) et 160 µM (1 :8). Cône de tension : 100 V.

Les résultats combinés montrent que la substitution S280F affaiblit à la fois la liaison de l'ivosidenib et favorise la conversion du 2-OG en 2-HG. Notamment, la substitution S280F du deuxième site favorise également, au moins par rapport aux substitutions simples R132C ou R132H, la conversion de l'isocitrate en 2-HG en l'absence d'inhibiteur (Fig. 1d). Fait intéressant, IDH1 S280F (sans R132C ou R132H) a augmenté l'efficacité catalytique pour le renouvellement de l'isocitrate en 2-OG, mais pas pour la réduction de 2-OG en 2-HG par rapport à IDH1 wt (tableau supplémentaire 1a / b; Fig. supplémentaire 3k / l), suggérant une coopération potentielle entre les deux sites en ce qui concerne l'augmentation de l'efficacité de la substitution de la conversion globale de l'isocitrate en 2-HG. Pour l'isocitrate et le 2-OG, la liaison au substrat (à en juger par KM) est augmentée dans IDH1 S280F (tableau supplémentaire 1a / b). Pour la réduction de 2-OG en 2-HG, le KM de Mg2+ pour IDH1 S280F est diminué de 100 fois par rapport à IDH1 wt, alors qu'il ne change pas pour la conversion d'isocitrate en 2-OG. Ces observations combinées impliquent que la substitution S280F favorise la liaison au substrat (isocitrate ou 2-OG), mais les effets sur la liaison Mg2+ dépendent de la réaction catalysée, c'est-à-dire isocitrate en 2-OG ou 2-OG en 2-HG. Cette conclusion est cohérente avec des travaux récents montrant que la liaison des substrats et du Mg2+ aux variants d'IDH1 implique des changements conformationnels, y compris des mouvements des hélices α (α9 et α10) impliquées dans la formation de l'interface dimère18 ; notez qu'il existe des preuves que IDH1 manifeste une réactivité d'un demi-site27. Notamment, l'ivosidenib et, au moins, certains autres inhibiteurs de variantes de l'IDH peuvent également se lier à IDH1 wt (et probablement IDH2 wt), mais ne les inhibent pas efficacement18. Ces observations illustrent la complexité de la dynamique conformationnelle à l'interface dimère IDH1 et comment elles sont liées à la chimie du site actif. Ces problèmes mécanistes subtils, y compris la modulation potentielle de Mg2+ et la liaison au substrat, rendent difficile la prédiction précise de la manière dont la liaison allostérique du ligand au site dimère-interface se manifestera en termes d'inhibition. Nous avons ainsi criblé un ensemble de 14 inhibiteurs de variants IDH rapportés contre R132C / S280F et R132H / S280F avec des enzymes isolées (Fig. 4a / c supplémentaire).

Fait important, bien que sept des inhibiteurs n'aient pas manifesté d'inhibition de R132C/S280F ou R132H/S280F (dont un, SYC-435, signalé comme se liant au site actif28), les résultats du dépistage (Fig. 4c supplémentaire) ont révélé que sept des inhibiteurs conservaient une activité contre les doubles variants, à savoir GSK321, GSK864, IDH224, IDH305, IDH556, FT-2102 et DS-1001B. Certains de ces inhibiteurs manifestent une puissance élevée (IC50 < 100 nM), à savoir IDH224, FT-2102 (uniquement contre R132H/S280F) et DS-1001B (Fig. 3a). Des inhibiteurs représentatifs puissants de chaque série d'inhibiteurs ont été sélectionnés pour d'autres études (c'est-à-dire GSK864, IDH224, FT-2102, DS-1001B). De manière frappante, des études sur la SEP non dénaturante ont montré que tous ces inhibiteurs peuvent se lier avec une stoechiométrie de 2 molécules à chaque dimère IDH1 (Fig. 3b; Fig. Supplémentaire 4d). Notez que cette observation contraste avec celle de l'ivosidenib, où une seule molécule inhibitrice a été observée pour se lier au dimère IDH1 (Fig. 2c). L'affinité de liaison à l'inhibiteur (déterminée par MS non dénaturante) était généralement plus faible pour R132C/S280F et R132H/S280F que R132C et R132H, bien qu'elle ne soit pas modifiée pour FT-2102 (Fig. 3c). L'inhibiteur R132C/S280F le plus puissant, DS-1001B, a également été analysé dans un test en solution (employant la RMN CPMG) et s'est avéré manifester une liaison étroite à toutes les variantes testées, avec la plus faible affinité pour R132H/S280F (KD = 4,19 µM) par rapport aux autres variantes IDH1 testées (Fig. 3c).

a Valeurs IC50 (erreur standard de la moyenne, n = 3) avec les variants IDH1 (à 30 nM) ; ni = aucune inhibition observée. Conditions : Tris 100 mM, MgCl2 10 mM, DTT 0,2 mM, Tween 20 0,005 % v/v et BSA 0,1 mg/mL (pH 8,0). b Analyses MS non dénaturantes. Ligne pointillée : dimère IDH1 (z = 20, avec 2 molécules NADP(H) liées), la couleur verte correspond à la liaison d'une molécule inhibitrice, la couleur menthe correspond à la liaison de 2 molécules inhibitrices. Conditions : 20 µM IDH1 variant, 20 µM inhibiteur, cône-voltage : 100 V. c KD déterminations (erreurs standard de la moyenne) mesurées par MS non dénaturante (20 µM enzyme, erreurs techniques : n = 3 pour les états de charge z = 19, 20, 21) et CPMG RMN (valeurs entre parenthèses, 10 µM enzyme, n = 2). SM non dénaturant : tampon citrate d'ammonium (200 mM, pH 7,5) ; RMN CPMG : Tris-dll 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM et D2O 10 %, pH 7,5.

Les essais de rotation utilisant l'essai d'absorbance du NADPH impliquent que l'inhibition de R132C, R132C/S280F, R132H et R132H/S280F est apparemment compétitive par rapport aux niveaux de Mg2+ et 2-OG ; la puissance de l'inhibiteur n'a pas été sensiblement influencée par les variations des concentrations de NADPH, sauf potentiellement avec le FT-2102 (Fig. 5a – c supplémentaires).

Pour étudier plus avant les effets de la substitution S280F sur la liaison de l'inhibiteur, nous avons travaillé pour acquérir des informations cristallographiques et avons obtenu une structure de R132C/S280F complexé avec du calcium, du 2-OG et du NADPH (résolution de 2,1 Å, groupe spatial : C2221, trois molécules (A – C) dans l'unité asymétrique (Fig. 6a supplémentaire), PDB : 7PJM ; la structure a été résolue à l'aide d'une structure rapportée de R132H, en tant que modèle de recherche19 ; Fig. 4a–d).

une vue ruban d'une structure cristalline de R132C/S280F (PDB : 7PJM, résolution 2,1 Å). Comme observé dans l'unité asymétrique, un dimère apparent est formé par la chaîne A (blé) et la chaîne B (vert). Cercles orange : sites actifs avec 2-OG, NADPH et calcium. Boucle L1 : violette. b Vue rapprochée avec une carte omise des polders (maille bleue, contour 3,0 σ) montrant le 2-OG, le NADPH et le calcium. La boucle L1 recouvrant l'interface dimère est en violet. Cercle noir : dimère-interface avec une carte d'omission de Polder (maille bleue, contour : 3,0 σ) montrant F280 (cyan). c Vue de l'interface dimère mettant en évidence les interactions hydrophobes entre W124 (L1), F280 (cyan, α10) et W267 dans les deux monomères. d Vue du chantier de reliure des métaux. Les résidus de liaison au calcium D252 (monomère 1, blé, α9), D275 et D279 (monomère 2, vert, α10) sont représentés. e Vue en ruban d'une structure cristalline de R132C/S280F (PDB : 7PJN), résolution de 2,45 Å) complexé avec 2 molécules de NADPH et 2 DS-1001B (orange) ; l'enzyme est probablement dans une conformation ouverte inactive. Un dimère apparent est formé par la chaîne B (blé) et la chaîne C (vert), comme observé dans l'unité asymétrique. DS-1001B se lie à l'interface dimère (cercle noir). f Polder omettre la carte (maille bleue, contour : 3,0 σ) montrant DS-1001B et le résidu F280 (cyan) dans l'interface dimère. Notez que la boucle L1 (violette) recouvre l'interface dimère.

La comparaison avec les structures IDH1 rapportées implique que la structure R132C / S280F reflète probablement une conformation de site actif fermé (les largeurs des deux fentes de site actif dans l'homodimère apparent formé par les chaînes A et B mesurées par les distances entre I76 et L250, qui sont des résidus à l'entrée du site actif29, sont de 12, 6 Å et 13, 0 Å, indiquant une conformation fermée 29; Fig. 6b / c supplémentaire ). La structure révèle que les cycles phényle des deux résidus S280F, situés sur α10, sont adjacents l'un à l'autre à l'interface dimère (Fig. 4a/b) ; avec les chaînes latérales de W124 et W267, le groupe phényle de S280F crée une région hydrophobe accrue à l'interface dimère (Fig. 4c) reflétant peut-être les stabilités thermiques accrues des variantes S280F (Fig. 1b; Fig. Supplémentaire 1j).

Dans la structure R132C/S280F, il est à noter que la boucle L1, qui recouvre partiellement la poche de liaison de l'inhibiteur30 (Fig. 4b ; Fig. Supplémentaire 7a/b), adopte une conformation différente de celle observée dans une structure cristalline R132H complexée avec du calcium, du 2-OG et du NADPH19. Bien que la différence dans la conformation de la boucle L1 puisse (en partie) refléter des conditions de cristallisation différentes, cette observation confirme l'importance des mouvements conformationnels pendant la catalyse et l'inhibition d'IDH1. De plus, il existe des différences dans la conformation du résidu de liaison au métal Asp-252 (Fig. 4d; Fig. Supplémentaire 7c / d) dans la structure R132C / S280F par rapport à celles observées dans d'autres structures, y compris R132H19. Cependant, la nature globale de la liaison 2-OG, qui comprend la chélation par l'ion calcium, est inchangée dans les différentes structures (Fig. 7d supplémentaire).

Nous avons obtenu une structure cristalline de R132C/S280F complexée avec du NADPH et son puissant inhibiteur DS-1001B (résolution de 2,45 Å, groupe spatial : P21212, quatre molécules (A – D) dans l'unité asymétrique (Fig. 8a supplémentaire), PDB : 7PJN ; la structure a été résolue en utilisant une structure liée à l'inhibiteur rapportée de R132H comme modèle de recherche31 ; Fig. 4e/f). Conformément aux résultats de la SEP non dénaturante (Fig. 3b), la structure révèle deux molécules DS-1001B liées à l'interface dimère (Fig. 4e). Fait intéressant, les deux molécules DS-1001B se lient de manière à ce que leurs cycles trichlorophényle soient adjacents, une observation intéressante en ce qui concerne les futurs efforts de chimie médicinale visant à améliorer la liaison des inhibiteurs (Fig. 4f). La structure complexe DS-1001B reflète probablement une conformation ouverte ou semi-ouverte (inactive) : les largeurs des deux fentes de site actif dans l'homodimère apparent formé par la chaîne B et la chaîne C, mesurées par les distances entre I76 et L250, sont de 17,7 Å (semi-ouvert) et 20,2 Å (ouvert ; Fig. 8b/c supplémentaire). Comme indiqué précédemment pour la conformation inactive23, α10 dans les deux monomères est partiellement désordonné et prend une conformation en boucle partielle (Fig. 9 supplémentaire), ce qui aide potentiellement à s'adapter à la liaison de l'inhibiteur. Notamment, contrairement à la structure de R132C/S280F sans inhibiteur, dans la structure complexée DS-1001B, les résidus S280F des deux monomères ne sont pas adjacents mais distants de 14,9 Å (atome C le plus proche, Fig. 10 supplémentaire).

Bien qu'il faille veiller à ne pas surinterpréter les différences de structures cristallines obtenues dans différentes conditions, conformément aux études en solution, nos résultats cristallographiques montrent que la substitution S280F affecte à la fois la chimie à l'interface dimère où l'ivosidenib se lie probablement et qu'elle a le potentiel d'affecter la chimie du site actif, y compris en ce qui concerne la liaison des ions métalliques et, par conséquent, la liaison au substrat. Lorsqu'ils sont combinés avec d'autres structures et des études cinétiques et autres études biophysiques récentes18,27, ces résultats biophysiques soulignent davantage le rôle de la dynamique conformationnelle et de la complexité dans la catalyse IDH (variante). Définir la nature précise de ceux-ci et leurs effets inhibiteurs est un défi et nécessite des études structurelles sur les chiffres d'affaires individuels couplées à une modélisation. Par conséquent, nous proposons que l'inhibition des variants IDH, y compris en ce qui concerne la lutte contre les résistances, soit principalement poursuivie par une approche guidée empiriquement utilisant différents types de renouvellement et d'essais de liaison liés à des études cellulaires à un stade précoce.

Cette approche est étayée par les résultats d'études cellulaires sur cinq inhibiteurs (potentiels) R132C/S280F sélectionnés, à savoir l'ivosidenib, le GSK864, l'IDH224, le FT-2102 et le DS-1001B (Fig. 5). Une lignée cellulaire de glioblastome LN-18 (ATTC CRL-2610) a été utilisée pour produire des variants IDH1 recombinants (R132C, R132C/S280F, R132H, R132H/S280F) comme indiqué dans la Fig. 11 supplémentaire.

Les cellules LN18 ont été traitées avec les inhibiteurs ivosidenib, GSK864, FT-2102, IDH224 et DS-1001B dans du DMSO (concentration finale : 5 µM). Les taux de 2-HG ont été déterminés par chromatographie échangeuse d'anions couplée au MS51 (erreurs : erreurs standard de la moyenne, n = 4 réplicats indépendants). Notez que, alors que l'ivosidenib n'est pas/peu actif dans la réduction des niveaux de 2-HG dans les cellules porteuses de R132C/S280F et R132H/S280F, les autres inhibiteurs sont actifs dans la réduction des niveaux de 2-HG. Les cellules témoins ont été générées par transduction avec des vecteurs lentiviraux ne contenant pas d'IDH1. Graphiques en boîte à moustaches : la ligne médiane est la médiane et les limites sont les valeurs des 25e et 75e centiles. Les moustaches sont les niveaux de 2-HG mesurés minimum et maximum pour chaque groupe expérimental. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Comme prévu, avec les cellules témoins, qui n'expriment aucun variant d'IDH1, les inhibiteurs n'ont eu aucun effet détectable, dans les limites de l'erreur, sur les faibles niveaux de 2-HG endogène présents (Fig. 5). Conformément aux résultats rapportés24,26,32, tous les inhibiteurs ont efficacement supprimé la production de 2-HG dans les cellules surproduisant R132C et R132H. En revanche, les effets des cinq inhibiteurs sur les cellules surproduisant R132C/S280F ou R132H/S280F variaient. Conformément aux données biochimiques montrant que la substitution S280F entraîne une résistance à l'ivosidenib et aux résultats cliniques antérieurs14,15,16, l'ivosidenib était inefficace pour supprimer la production de 2-HG dans les cellules surproductrices de R132C/S280F et R132H/S280F (Fig. 5). Dans les cellules surproductrices de R132C/S280F, GSK864 n'était que modérément puissant pour réduire les niveaux de 2-HG, alors que IDH224, DS-1001B et FT-2102 étaient plus puissants pour réduire les niveaux de 2-HG. Fait intéressant, le FT-2102 était relativement moins puissant que l'IDH224 et le DS-1001B contre le R132C/S280F isolé (Fig. 3a ; IC50 1,3 µM). La puissance relativement élevée du FT-2102 dans les cellules peut refléter une perméabilité cellulaire accrue par rapport à IDH224 et DS-1001B.

Dans le cas de R132H/S280F (Fig. 5), les résultats du traitement par ivosidenib, GSK864, IDH224 et FT-2102 étaient analogues à ceux des cellules porteuses de R132C/S280F. De manière frappante, cependant, DS-1001B était un inhibiteur relativement faible de R132H/S280F dans ce contexte cellulaire. Cette différence reflète probablement, au moins en partie, l'IC50 plus élevée pour le DS-1001B par rapport au R132H/S280F isolé par rapport aux valeurs des autres variantes IDH1 testées (Fig. 3a).

Bien qu'il existe des différences dans les efficacités relatives des inhibiteurs, comme décrit ci-dessus, les résultats cellulaires sont bien corrélés avec les résultats pour les variants IDH1 isolés. Plus important encore, ils révèlent que des inhibiteurs spécifiques, dont le FT-2102 et le DS-1001B, qui sont en cours d'essais cliniques de phase 233,34,35, sont efficaces pour réduire les niveaux de 2-HG dans les cellules porteuses de R132C/S280F.

Le développement d'inhibiteurs de variantes de l'IDH est une percée dans le traitement du cancer car il s'agit d'un exemple pionnier de la façon dont le métabolisme peut être ciblé avec succès par des médicaments à petites molécules. Cependant, comme prévu, une résistance est apparue au médicament pionnier ivosidenib, en particulier via la substitution S280F à l'interface dimère14,15,16. Les résultats du dépistage des inhibiteurs avec des variants IDH1 isolés révèlent que ni les variants R132C/S280F, ni les variants R132H/S280F ne sont (efficacement) inhibés par l'ivosidenib. Cependant, il est important de noter que ce résultat est également le cas pour certains, mais pas tous, des variants inhibiteurs de l'IDH signalés actuellement en développement. Ainsi, il devrait être possible de surmonter la résistance aux inhibiteurs des variants de l'IDH causée par les mutants d'interface dimère par des programmes de chimie médicinale appropriés.

Les résultats biochimiques et structurels combinés montrent que la substitution S280F permet la résistance à l'ivosidenib dans les cellules cancéreuses produisant R132C/S280F ou R132H/S280F en partie en empêchant sa liaison à l'interface dimère IDH1 et en partie en augmentant l'efficacité des variants R132C et R132H pour catalyser la conversion de l'isocitrate et/ou du 2-OG en 2-HG. Les études rapportées ici et ailleurs18 impliquent que la liaison allostérique des inhibiteurs variants de l'IDH à l'interface dimère affecte la liaison du site actif Mg2+ (ou du complexe Mg2+-substrat dans le cas de l'isocitrate) d'une manière qui inhibe de manière disproportionnée la conversion de 2-OG en 2-HG par rapport à la conversion de l'isocitrate en 2-OG. Les raisons moléculaires précises de ces observations, ainsi que les détails de la catalyse IDH1 wt, devraient faire l'objet de futures études biophysiques résolues dans le temps.

Bien que la pertinence in vivo pour le cancer de l'efficacité catalytique accrue observée du R132C S280F in vitro soit inconnue, cela peut aider à maintenir des niveaux élevés de 2-HG en présence d'un inhibiteur de variant IDH. Si tel est le cas, il soutient un rôle fonctionnel du 2-HG dans les cellules cancéreuses matures et, par conséquent, un traitement à base d'inhibiteurs entraînant une réduction des niveaux de 2-HG ; notez que le rôle du 2-HG dans les cellules cancéreuses matures peut être différent ou en plus du rôle proposé des niveaux élevés de 2-HG dans la tumorigenèse36,37.

Malgré la complexité mécanistique de l'inhibition de la variante IDH1 par la liaison allostérique, nos résultats montrent clairement que la résistance médiée par R132C/S280F à l'ivosidenib peut être surmontée en utilisant d'autres inhibiteurs, par exemple IDH224, FT-2102, DS-1001B, et probablement des variantes améliorées de ceux-ci. Comme l'ivosidenib, ces inhibiteurs se lient également à l'interface dimère ; cependant, contrairement à l'ivosidenib, qui se lie avec une stœchiométrie d'une molécule inhibitrice par dimère de variante IDH1, les puissants inhibiteurs du R132C/S280F (comme le montrent les études biochimiques et cellulaires) se lient avec une stœchiométrie de deux molécules inhibitrices par dimère, comme le montrent les études de SEP non dénaturantes et les analyses cristallographiques du R132C/S280F avec et sans inhibiteur. Fait important, deux inhibiteurs du R132C/S280F et du R132H/S280F, le FT-2102 et le DS-1001B sont déjà en phase 2 d'essais cliniques33,34,35. Il existe donc la possibilité de développer des schémas thérapeutiques efficaces impliquant la substitution d'un variant inhibiteur de l'IDH par un autre au fur et à mesure que la résistance émerge. Il est également possible d'utiliser des combinaisons d'inhibiteurs, en particulier lorsque les types de résistance susceptibles d'apparaître peuvent être prédits avant le traitement initial.

Des études récentes sur les mécanismes d'IDH1 et de ses variants et le mode d'action des inhibiteurs de variants d'IDH rapportés18 ont conduit à la suggestion que les inhibiteurs allostériques étaient préférentiellement identifiés en partie en raison des conditions de dépistage utilisées, c'est-à-dire que les dépistages n'étaient pas effectués avec des concentrations variées de Mg2+. La nature du S280F a permis la résistance de l'ivosidenib au R132C/S280F suggère que le développement de nouveaux types d'inhibiteurs de l'IDH, y compris ceux qui ne fonctionnent pas par liaison allostérique à l'interface dimère, est intéressant. Il est possible que la liaison des inhibiteurs à l'interface dimère IDH, qui est impliquée dans des changements conformationnels subtils au cours de la catalyse, soit particulièrement sujette à la résistance par rapport à ceux qui se lient au site actif et/ou en compétition avec le NADPH. Il convient toutefois de noter que la substitution S280F confère une résistance à un inhibiteur, SYC-435, qui se lierait au site actif IDH128.

En raison du peu de données cliniques disponibles à ce stade, il est difficile de prédire comment la résistance émergera aux variants inhibiteurs de l'IDH. Nous suggérons donc que parallèlement à l'optimisation des inhibiteurs actuellement efficaces, qui se lient à l'interface dimère, le développement d'inhibiteurs variants de l'IDH fonctionnant via des mécanismes n'impliquant pas de liaison allostérique vaut la peine. Nos résultats impliquent également que les futurs efforts de chimie médicinale devraient utiliser de manière optimale plusieurs variants IDH1/2, y compris des mutations activant la résistance sous forme isolée (dans différentes conditions d'essai) ainsi que des analyses cellulaires et in vivo guidées empiriquement.

Des amorces directes et inverses pour introduire différentes mutations ont été conçues selon les procédures rapportées38. Un plasmide pET22b (Sigma-Aldrich) a été utilisé comme matrice. IDH1 R132H/S280F et R132C ont été fabriqués à partir d'une matrice d'ADN IDH1 R132H (obtenue comme décrit18). IDH1 R132C/S280F et R132C/S280A ont été fabriqués à partir d'une matrice d'ADN R132C. IDH1 S280F a été fabriqué à partir d'une matrice d'ADN IDH1 wt. Les réactions ont été menées (méthode en 2 étapes) à l'aide de l'ADN polymérase Q5® haute fidélité (New England Biolabs), d'un mélange de solution de désoxynucléotide (New England Biolabs) et d'un système PCR GeneAmp 9700 (Applied Biosystems). Le mélange a été purifié à l'aide du kit de purification GeneJET PCR (Thermo Scientific) selon le protocole du fabricant. L'ADN matrice a été digéré à l'aide de Dpn1 (New England Biolabs; incubation de 3 h, 37 ° C). Le produit a été transformé dans des cellules XL10-gold (Agilent). Les colonies ont été cultivées pendant une nuit dans 10 ml de milieu 2TY et le plasmide a été extrait à l'aide du kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Scientific). Les plasmides ont été élues avec de l'eau purifiée MilliQ. Les séquences ont été confirmées par séquençage Sanger réalisé par Eurofins Scientific.

La production de protéines recombinantes a été réalisée comme décrit17,18. En bref, les protéines recombinantes ont été produites dans des cellules BL21 (DE3) plysS E. coli avec 1 mM d'isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) avec une température de post-induction de 20 ° C. Les cellules ont été récoltées par centrifugation et lysées par sonication. Les lysats cellulaires ont été chargés sur une colonne HisTrap HP de 5 ml (Cytiva) et élués avec un gradient d'étape d'imidazole (jusqu'à 500 mM). Les fractions contenant la protéine souhaitée ont été davantage purifiées à l'aide d'une colonne Superdex S200 (GE Healthcare, 300 ml) par élution isocratique. La pureté des fractions a été évaluée par électrophorèse sur gel SDS PAGE (Fig. 1a supplémentaire). Les concentrations en protéines ont été déterminées à l'aide d'un appareil Nanodrop One (Thermo Scientific) et correspondent à la concentration en monomère IDH1.

Pour les études cristallographiques, IDH1 R132C/S280F a été en outre purifié par chromatographie échangeuse d'anions. Après purification initiale à l'aide d'une colonne HisTrap HP de 5 ml (Cytiva), les fractions contenant la protéine souhaitée ont été soumises à un échange de tampon à l'aide d'une colonne PD-10 (Merck) et chargées sur une colonne Cytiva Q Sepharose Fast Flow. La protéine a été éluée avec un gradient de NaCl (jusqu'à 1 M) puis soumise à une purification par filtration sur gel (colonne Superdex S200 (GE Healthcare, 300 mL), avec élution isocratique à l'aide d'un tampon contenant du Tris 20 mM et du NaCl 100 mM (pH 7,4).

Pour les expériences électrochimiques, la ferrédoxine-NADP+ réductase (FNR) de Chlamydomonas reinhardtii a été produite comme décrit39. En bref, le FNR recombinant a été produit dans des cellules BL21 (DE3) plysS E. coli en ajoutant 1 mM d'IPTG, et les cultures ont été cultivées pendant 4 h supplémentaires (37 ° C). Les cellules ont été récoltées par centrifugation ; les culots ont été remis en suspension dans un petit volume de tampon froid (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, DTT 1 mM; pH 7, 4) et stockés pendant une nuit à -80 ° C. Les cellules ont été décongelées et lysées à l'aide d'une presse française à 20 psi, et le lysat a été centrifugé à 4 ° C à l'aide d'une ultracentrifugeuse (Beckman L8-70M Ultracentrifuge). Le FNR a été isolé du surnageant à l'aide d'une colonne d'affinité Ni2+ HisTrap HP (GE Healthcare Life Sciences) et élué de la colonne à l'aide d'un gradient d'imidazole (concentration finale de 250 mM d'imidazole). Les fractions contenant du FNR ont été sélectionnées sur la base de l'absorbance à 280 nm et 460 nm. Les fractions contenant du FNR ont été combinées et concentrées à l'aide de filtres centrifuges Amicon Ultra-4 ml (10 kDa) jusqu'à un volume final d'environ 2 ml. La solution concentrée de FNR a ensuite été appliquée à une colonne de dessalage (PD-10; GE Healthcare) pour éliminer l'imidazole. L'enzyme a été séparée en aliquotes à usage unique, congelées rapidement dans de l'azote liquide, puis stockées à -80 ° C.

La cinétique enzymatique a été déterminée par spectrophotométrie sur la base des changements de concentration de NADPH mesurés par son absorption à 340 nm (ε = 6220 M–1 cm–1). Les analyses ont été effectuées dans des plaques de microtitrage transparentes à 96 puits et demi-zone (Greiner Bio-One 675001) à l'aide d'un lecteur de microplaques PHERAstar FS à 25 °C dans un volume de réaction de 100 µL. Ce test a été utilisé pour étudier la cinétique à l'état d'équilibre et l'inhibition des réactions catalysées par les variants IDH1. Le tampon de dosage était Tris 100 mM, MgCl2 10 mM, dithiothréitol (DTT) 0,2 mM, Tween 20 à 0,005 % (v/v) et 0,1 mg mL-1 d'albumine de sérum bovin (BSA) (pH 8,0). Pour les tests d'inhibition, les variants IDH1 ont été incubés avec un inhibiteur pendant 12 min avant que la réaction ne soit initiée par l'ajout de substrat. L'erreur standard a été dérivée de l'ajustement de la courbe à l'aide de GraphPad Prism v9. Voir les légendes des figures pour plus de détails sur les dosages cinétiques spécifiques (Figs. 1–3 ; Fig. 5 supplémentaire ; Tableau supplémentaire 1).

Le sel disodique de 2-oxoglutarate (2-OG), le sel tétrasodique de NADPH (~ 98 %), le sel disodique de NADP+, le sel de potassium D-isocitrate et le MgCl2 × 6 H2O provenaient de Sigma-Aldrich. Le sel trisodique de l'acide DL-isocitrique provenait de ChemCruz. Les inhibiteurs provenaient de MedChemExpress, BioVision, DC Chemicals, Sigma-Aldrich, Enzo Life Sciences, Cambridge Bioscience Ltd. GSK321 et GSK864 ont été aimablement fournis par GSK. Les solutions mères ont été préparées dans du DMSO (10 mM).

Les variants IDH1 ont été échangés avec un tampon RMN (Tris-d11 50 mM, NaCl 100 mM, D2O 10 %, pH 7,5) à l'aide de colonnes Micro Bio-Spin 6 (Bio-Rad) selon le protocole du fabricant. Les spectres de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ont été obtenus à l'aide d'un spectromètre RMN Bruker AVIII 700 MHz équipé d'une cryosonde TCI 1H/13C/15N inverse de 5 mm. Du MgCl2 (10 mM), de l'isocitrate/2-OG et du NADP+/NADPH ont été ajoutés pour les essais de renouvellement, et le renouvellement a été contrôlé par RMN 1H (NS : 16, délai de relaxation : 2 s). Le signal de l'eau a été supprimé par sculpture d'excitation. Les données ont été analysées à l'aide de Mestrenova.

Les variantes d'IDH1 ont été échangées avec un tampon RMN (50 mM Tris-d11, 100 mM NaCl, 10 % D2O, pH 7,5) et concentrées à l'aide de filtres Amicon Ultra Centrifugal (0,5 mL, coupure : 50 kDa) selon le protocole du fabricant. Des expériences ont été menées avec 10 uM d'inhibiteur (provenant d'un stock de d6-DMSO 10 mM). Le variant IDH1 a été titré dans cette solution, et la séquence PROJECT-CPMG a été appliquée40. Les paramètres expérimentaux étaient les suivants : temps d'écho total, 40 ms ; délai de relaxation, 2 s. La suppression de l'eau a été réalisée par pré-saturation. Le pourcentage de complexe protéine-inhibiteur ([PL]/([P] + [PL]) a été tracé en fonction de la concentration d'inhibiteur. Les données ont été analysées à l'aide de Mestrenova et la constante de dissociation a été calculée à l'aide d'une régression non linéaire par GraphPad Prism (version 9).

Les variants IDH1 ont été échangés avec un tampon dans un tampon phosphate de sodium (10 mM, pH 8,0) en utilisant des colonnes Micro Bio-Spin 6 (Bio-Rad) conformément au protocole du fabricant. Les mesures de CD ont utilisé un spectromètre Chirascan CD (Applied Photophysics) équipé d'un porte-cellule Peltier à température contrôlée. Les spectres ont été enregistrés dans une plage de 260 à 185 nm (intervalles de 0,5 nm). Les mesures ont été effectuées en triple à 23 ° C, et le bruit de fond a été soustrait de celui de l'échantillon. Les spectres ont été moyennés et lissés à l'aide du filtre Savitzky – Golay (taille de fenêtre 4). Les données ont été normalisées à la concentration en protéines (mesurée à l'aide d'une machine NanoDrop One) et l'ellipticité moyenne des résidus a été calculée selon la formule [Eq. 1]:

Pour analyser la stabilité thermique des variants IDH1, la longueur d'onde a été fixée à 215 nm et la température a progressivement augmenté de 10 à 80 °C. La vitesse de chauffage était de 1 °C min−1 et le signal CD était mesuré tous les 2 °C (±0,4 °C). Les spectres ont été lissés à l'aide du filtre Savitzky – Golay (polynôme d'ordre 4, 12 voisins) de GraphPad Prism (version 9). La température de fusion a été calculée à l'aide d'un modèle sigmoïde de Boltzmann avec Graph Pad Prism (version 9) ; l'erreur standard a été dérivée de l'ajustement de la courbe à l'aide du modèle sigmoïde de Boltzmann.

Les mesures ont été effectuées dans un tampon Tris (50 mM, pH 7,4) avec 3 µM de protéine et 3 × Sypro Orange sur un cycleur thermique Bio-Rad CFX96. Le taux de chaleur était de +0,2 °C s−1 dans une plage de 20 à 95 °C. Les données ont été analysées à l'aide de Bio-Rad CFX Manager 3.1. L'erreur standard a été dérivée de trois répétitions indépendantes.

Des gels de Tris-glycine Novex™ WedgeWell™ 4–12 % ont été utilisés. La chambre de gel (Invitrogen) a été refroidie dans un bain de glace et l'électrophorèse sur gel a été réalisée dans une chambre froide (4 ° C) en utilisant un tampon de fonctionnement NativePAGE (Invitrogen). L'électrophorèse sur gel a été réalisée pendant 1,5 h à 160 V et le gel a été coloré à l'aide d'InstantBlue Coomassie (Expedeon).

Les mesures SEC-MALS ont été effectuées à l'aide d'un détecteur de diffusion de lumière à 8 angles Wyatt Dawn HELEOS-II et d'un moniteur d'indice de réfraction Wyatt Optilab rEX reliés à un système HPLC Shimadzu comprenant une pompe LC-20AD, un échantillonneur automatique SIL-20A et un détecteur UV/Vis SPD20A. Les échantillons ont été analysés avec une colonne Superdex 200 HR10/30 avec un débit de 0,5 ml min-1. La concentration de l'échantillon était de 1 mg mL-1 dans un tampon contenant du Tris (20 mM, pH 7,4) et du NaCl (100 mM).

Des expériences électrochimiques ont été réalisées dans une boîte à gants anaérobie (Glove Box Technology) contenant une atmosphère d'azote (O2 < 1 ppm). L'appareil électrochimique (une cellule électrochimique en verre et des électrodes rotatives en graphite pyrolytique (PGE)) était comme indiqué précédemment17. Un potentiostat Autolab PGSTAT 10 utilisant le logiciel Nova a été utilisé pour mener des expériences électrochimiques. Les potentiels d'électrode (E) ont été mesurés par rapport à une électrode au calomel saturé (SCE) et convertis en électrode à hydrogène standard (SHE) à l'aide d'une équation de conversion de potentiel dépendant de la température (à 25 °C, la conversion est : ESHE = ESCE + 0,241 V)17. La contre-électrode était un fil de platine. Des électrodes nanoporeuses en oxyde d'indium et d'étain (ITO) ont été fabriquées en déposant par électrophorèse des nanoparticules d'ITO (<50 nm, Sigma-Aldrich) sur des électrodes de bord en graphite pyrolytique (ITO/PGE)17. Les enzymes ont été chargées sur l'électrode en coulant une solution enzymatique mixte de 4 à 6 µL sur l'électrode ITO et en la laissant incuber à température ambiante pendant au moins 30 min tout en veillant à ce que la solution ne s'évapore pas. Dans tous les cas, 0,85 nmol (base homodimère) d'IDH1 (type sauvage et tous les variants) a été utilisé ; la quantité de FNR qui a été co-chargée a été ajustée pour obtenir le rapport enzymatique final souhaité. Tous les variants IDH1 néomorphes testés (R132C, R132C/S280F, R132H, R132H/S280F) ont été chargés à un rapport molaire de 2,5 à 1 avec du FNR (c'est-à-dire 2,5 fois plus (équivalent molaire homodimère) de chaque variant IDH1 a été chargé par rapport au FNR pour chaque expérience). En revanche, IDH1 wt et IDH1 S280F ont été chargés à un rapport molaire de 1 à 8 avec FNR pour s'assurer que le système n'était pas limité par FNR en raison de ces enzymes IDH1 oxydant le DL-isocitrate à un rythme beaucoup plus rapide que les variantes néomorphes IDH1. Les concentrations d'IDH1 ont été calculées sur la base de leurs homodimères. Les électrodes chargées d'enzyme ont été soigneusement rincées à l'aide d'une solution tampon avant de les immerger dans le tampon de réaction pour chaque expérience afin de s'assurer qu'il n'y avait pas d'enzyme libre dans la solution.

Les variants IDH1 ont été échangés avec un tampon dans un tampon MS non dénaturant (acétate d'ammonium, 200 mM, pH 7, 5) à l'aide de colonnes Micro Bio-Spin 6 (Bio-Rad) conformément au protocole du fabricant. Des expériences MS non dénaturantes ont été réalisées à l'aide d'un instrument quadripolaire-TOF (Waters Synapt G2Si) et d'un échantillonneur automatique ESI à puce Advion Triversa Nanomate. Les inhibiteurs ont été dissous dans MeOH et ajoutés à la solution de protéine (concentration finale de protéine : 20 uM). Une tension de pulvérisation de 1,7 à 1,8 kV (pression du gaz de support de pulvérisation 0,6 psi, pression d'entrée 3,7 mbar) a été appliquée. Les tensions de cône d'échantillon étaient de 100 V et 5,2 V. Les spectres ont été analysés à l'aide de Mass Lynx (version 4.1), y compris le centrage et le lissage. Le pourcentage de complexe protéine-inhibiteur ([PL]/([P] + [PL]) a été tracé en fonction de la concentration d'inhibiteur. Une correction de base a été appliquée et la constante de dissociation a été calculée à l'aide d'une régression non linéaire par GraphPad Prism (version 9).

IDH1 R132C/S280F (25,62 mg mL-1 dans Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4) a été utilisé pour la cristallisation en utilisant la méthode de diffusion de vapeur en goutte assise. Pour la configuration en goutte assise, une plaque Cryschem à 24 puits (Hampton Research, États-Unis) avec une solution de réservoir de 250 µL a été utilisée19. Un criblage faisant varier la concentration en PEG (PEG3350 15–20 %, axe horizontal par pas de 1 %) et la concentration en sel (acétate de calcium 200 ou 225 mM, axe vertical ; ensemencé ou non, respectivement) et Bis-Tris (0,1 M) à pH 7 a été réalisé. L'enzyme (25 µL) a été incubée pendant 1 h sur de la glace avec du NADPH 10 mM (dans H2O, 10 µL), du CaCl2 20 mM (dans H2O, 5 µL) et du 2-OG 200 mM (dans H2O, 10 µL) pour donner une concentration finale en protéines de 12,81 mg mL-1. La cristallisation a été réalisée par l'addition de 2 ul de la solution contenant la protéine à une solution de précipitant de 2 ul. Les plaques ont été scellées avec StarSeal Advanced Polyolefin Film (Starlab, Allemagne); les cristaux (taille moyenne de 100 µM) se sont manifestés en 14 jours. Pour obtenir des cristaux de manière reproductible, un ensemencement a été utilisé avec broyage des cristaux à l'aide du kit SeadBeat (Hampton Research, USA) selon le protocole du fabricant. Les gouttelettes contenant des cristaux ont été cryo-protégées en les mélangeant dans un rapport de 1: 1 avec une solution de réservoir contenant du glycérol (25% (v/v)), récoltées avec une boucle en nylon et cryo-refroidies dans du N2 liquide. Les cristaux ont été stockés dans du N2 liquide jusqu'à ce qu'ils soient requis pour la collecte de données.

Les données ont été recueillies à 100 K à l'aide de la ligne de lumière I24 Diamond Light Source (DLS). Les données ont été indexées, intégrées et mises à l'échelle à l'aide de la stratégie Xia241 du pipeline de traitement automatique de la ligne de lumière (tableau supplémentaire 4). La structure cristalline IDH1 R132C/S280F a été déterminée par remplacement moléculaire (MR) à l'aide du sous-programme AutoMR (PHASER42) dans PHENIX43. Le modèle de recherche utilisé pour MR était basé sur IDH1 R132H (PDB : 4KZO19). Le modèle structurel a été optimisé par des cycles itératifs de reconstruction manuelle dans COOT44 et de raffinement cristallographique dans Phenix.refine45 (les détails de raffinement sont résumés dans le tableau supplémentaire 4).

IDH1 R132C/S280F (25,62 mg mL-1 dans 20 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 1 mM de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP), pH 7,4) a été utilisé pour la cristallisation. Pour la configuration de la goutte assise, une plaque Cryschem à 24 puits (Hampton Research, États-Unis) avec une solution de réservoir de 250 µL a été utilisée comme indiqué25. Un crible faisant varier la concentration en citrate d'ammonium (pH 7,0, 0,75–2 M, axe horizontal par pas de 0,25 M) et la concentration en DTT (1,5–3 mM, axe vertical par pas de 0,5 mM) a été réalisé. La protéine (12,5 µL) a été incubée sur de la glace pendant 1 h avec du NADPH (10 mM ; dans un tampon contenant du Tris 20 mM, du NaCl 100 mM, du TCEP 1 mM, pH 7,4 ; 5 µL), du tampon (6,8 µL) et un excès de 10 fois de DS-1001B (dans du DMSO, 0,7 µL) jusqu'à une concentration finale de protéine de 12,81 mg mL−1 . 2 µL de cette solution ont ensuite été ajoutés à 2 µL de solution de précipitation. La plaque de chute assise a été scellée avec le film StarSeal Advanced Polyolefin (Starlab, Allemagne) et les cristaux sont apparus après une journée. La récolte des cristaux a été effectuée avec du glycérol comme cryoprotecteur comme décrit ci-dessus.

Les données ont été recueillies à 100 K en utilisant le rayonnement synchrotron sur la ligne de lumière DLS I03. Les données ont été indexées, intégrées et mises à l'échelle à l'aide de la stratégie Xia241 du pipeline de traitement automatique de la ligne de lumière (tableau supplémentaire 4). Une solution MR initiale a été obtenue en utilisant une structure liée à un inhibiteur de IDH1 R132H (PDB : 5TQH31). Un modèle de départ a été reconstruit à partir de cette solution MR à l'aide de PHENIX AutoBuild45,46,47,48,49. Le modèle structurel a été optimisé par des cycles itératifs de reconstruction manuelle dans COOT44 et de raffinement à l'aide de Phenix.refine45 (les détails sont résumés dans le tableau supplémentaire 4). En raison de la résolution limitée (2,45 Å), les contraintes NCS ont été utilisées tout au long et le raffinement TLS des facteurs B (16 groupes TLS pour les quatre chaînes).

Des cellules de glioblastome humain LN18 ont été obtenues auprès de l'ATCC et cultivées selon les instructions du fournisseur. Les cellules LN18 ont été génétiquement modifiées pour surexprimer les transgènes codant pour IDH1 R132H, IDH1 R132C, IDH1 R132H/S280F ou IDH1 R132C/S280F en utilisant la transduction de vecteur lentiviral. Tout d'abord, la séquence mutante IDH1 S280F d'IDH1 a été générée par une approche basée sur la PCR recombinante, en utilisant les vecteurs de transfert lentiviraux pCC.sin.36.IDH1R132H.PPTWpre.CMV.tTA-S2tet et pCC.sin.36.IDH1R132C.PPTWpre.CMV.tTA-S2tet50, contenant les séquences R132H et R132C s de IDH1, comme modèles. Dans cette réaction, Primer1_forward et Primer1_reverse (tableau supplémentaire 2) ont été utilisés. L'amplicon mutant IDH1 S280F a ensuite été sous-cloné dans les mêmes vecteurs de transfert en utilisant BamH1-HF et Nhe1-HF. Par la suite, les séquences IDH1 R132H, R132C, IDH1 R132H/S280F ou IDH1 R132C/S280F ont été amplifiées dans des réactions de PCR en utilisant Primer2_forward et Primer2_reverse (tableau supplémentaire 2) et clonées dans le vecteur pUltra-Chili (AddGene), en utilisant Xma1 et NheI-HF. Les enzymes de restriction provenaient de New England Biolabs. Toutes les transformations bactériennes ont été réalisées en utilisant des cellules ultracompétentes XL10-Gold selon les instructions du fabricant. Toutes les constructions ont été vérifiées par séquençage Sanger en utilisant Primer3_forward et Primer3_reverse (tableau supplémentaire 2).

Tous les plasmides de transfert pUltra-Chili mutant IDH1 ont été encapsidés dans des vecteurs lentiviraux (LV) par transfection transitoire de cellules HEK293T avec les 3 plasmides d'encapsidation : pVSVg, pREV et pMDL. Les cellules HEK293T ont été cultivées dans IMDM (Sigma, I3390) complété avec 10% de FBS (Fisher Scientific, 11550356) et 5% d'antibiotique pen-strep (Sigma, P4458). 48 h après la transfection, le milieu conditionné HEK293T a été récolté, centrifugé et filtré à l'aide de filtres de 0,22 µm. La concentration en antigène viral p24 a été mesurée à l'aide d'un test ELISA de dosage immuno-enzymatique de profil de noyau p24 du VIH-1 Lenti-X p24 Rapid Titer kit conformément aux instructions du fabricant. Des dilutions en série de milieu conditionné fraîchement récolté ont été utilisées pour infecter 1,2 × 105 cellules LN18 dans une plaque à six puits en présence de polybrène (8 μg ml-1). En tant que contrôle, les cellules ont été transduites avec le vecteur lentiviral pUltra-Chili, contenant TdTomato, mais pas de séquences IDH1.

L'ARN a été extrait à l'aide du RNeasy Micro Kit (Qiagen) selon les instructions du fabricant. Si nécessaire, l'ADN complémentaire a été soumis à une transcription inverse à l'aide du kit de transcription inverse d'ADNc haute capacité (Applied Biosystems). La qPCR a été utilisée pour mesurer l'expression d'IDH1 dans les cellules témoins et transduites par LV à l'aide d'une sonde IDH1 TaqMan (Life Technologies) et du TaqMan Fast Universal PCR Master-Mix (Applied Biosystems). La réaction a été réalisée à l'aide du système de PCR en temps réel QuantStudio™ 5 Dx (Applied Biosystems) avec GAPDH servant de contrôle endogène (Life Technologies). L'expression de chaque gène cible a été évaluée à l'aide d'une approche de quantification relative (méthode 2 - ΔΔCT).

La solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de Dulbecco filtrée liquide et stérile, le sérum bovin fœtal (FBS) d'origine non américaine et le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 4500 mg L-1 de glucose et de bicarbonate de sodium, sans L-glutamine, provenaient de Merck Life Sciences. Le supplément GlutaMAXTM provenait de Thermo Fisher Scientific. Le diméthylsulfoxyde (DMSO) pour la biologie moléculaire provenait de Merck. Les filtres seringues stériles (diamètre 15 mm, pores 0,2 uM, membrane RC) provenaient de Corning. Les inhibiteurs ont été dissous dans du DMSO à une concentration de 5 mM et filtrés avant utilisation avec des filtres à seringue Corning® (cellulose régénérée, diamètre de 18 mm, pores de 0,2 pm).

Les cellules LN18 contenant un vecteur vide ou produisant un recombinant IDH1 R132C, IDH1 R132C / S280F, IDH1 R132H ou IDH1 R132H / S280F ont été incubés à 37 ° C et 5% de CO2 et cultivés dans DMEM (4500 mg L−1 glucose) utamaxtm. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits, avec 0,7 ml par puits à 200 000 cellules ml-1. Après 24 h d'incubation, le milieu d'origine a été remplacé par du milieu frais de 0,7 mL (DMEM (4500 mg de glucose L-1), 10 % de FBS et 1 % de GlutaMAXTM) avec soit 5 µM d'inhibiteur (ivosidenib, GSK864, IDH224, FT-2102, DS-1001B) soit 0,1 % de DMSO (échantillons témoins). Les cellules ont été incubées pendant 24 heures supplémentaires avant la récolte. Le milieu a été retiré par aspiration pendant la récolte avant que les puits soient doucement lavés deux fois avec 0,7 mL de PBS par puits. 75 µL de méthanol aqueux à 80 % (v/v) ont été ajoutés à chaque puits et la plaque a été placée sur de la neige carbonique. Les cellules ont été grattées et le contenu de chaque puits a été transféré dans des microtubes séparés.

Les extraits cellulaires ont été centrifugés à 14 000 g pendant 25 min. La concentration en ADN (ng µL-1) des surnageants a été mesurée à l'aide d'un ClarioStar Plus avec une plaque LVis (260 nm). 2,5 µL du surnageant ont été ajoutés dans chaque puits. La plaque a été blanchie avec 2,5 µL de méthanol aqueux à 80 % (v/v) par puits avant la mesure de la concentration d'ADN. Le surnageant restant de l'échantillon cellulaire a été transféré dans des flacons de récupération totale (Waters) et dilué par rapport à la concentration d'ADN. L'analyse par chromatographie d'échange d'anions-MS a été réalisée comme indiqué51 à l'aide d'un système de chromatographie ionique haute pression Dionex ICS-5000+ équipé d'une colonne piège régénérée en continu, d'un suppresseur Dionex ERS 500e et d'une colonne AS11-HC (2 × 250 mm, 4 μm), tous de Dionex (Sunnyvale, CA, USA). Celui-ci a été couplé directement à un Q-Exactive HF hybride quadripôle-Orbitrap MS via une sonde HESI II, tous deux de Thermo Fisher. La température de la colonne était de 30 °C et tous les échantillons ont été injectés avec une injection en boucle partielle de 5 µL. La phase mobile était des ions hydroxydes aqueux (débit : 0,250 mL min-1) avec le gradient suivant : 0 min, 0 mM ; 1 minute, 0 mM ; 15 minutes, 60 mM ; 25 min, 100 mM ; 30,1 minutes, 0 mM ; 37 minutes, 0 mM. Le suppresseur avait un débit de 0,500 mL min-1 et était utilisé en mode eau externe. Le SM fonctionnait en mode ions négatifs avec les paramètres de source suivants : débit de gaz gaine, 60 ; débit de gaz auxiliaire, 20 ; débit de gaz de balayage, 0 ; tension de pulvérisation 3,6 kV ; température capillaire, 300 °C ; Niveau RF de l'objectif S, 70 ; température de chauffe, 350 °C. Les paramètres de balayage MS et MS/MS étaient : microscans, 2 ; résolution, 7 × 104 ; Cible AGC, 1 × 106 ions ; maximum IT, 250 ms ; nombre de boucles, 10 ; Nombre de MSX, 1 ; fenêtre d'isolement, 2,0 m/z ; énergie de collision, 35 ; cible AGC minimale, 5 × 103 ions ; déclenchement de l'apex 1–15 s ; exclusion de charge 3–8, >8 ; exclusion dynamique, 20,0 s. Le temps de rétention du 2-HG a été déterminé par analyse de 1 µg mL-1 standard dans du méthanol aqueux à 80 % (v/v) (qualité HPLC, de Sigma-Aldrich).

Les données cristallographiques générées dans cette étude ont été déposées dans la base de données PDB sous les codes d'accession 7PJM et 7PJN. Les données sources sont fournies avec ce document. Toute information supplémentaire requise pour réanalyser les données rapportées dans cet article est disponible sur demande auprès des auteurs correspondants. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Bardella, C. et al. L'expression de Idh1R132H dans la niche de cellules souches de la zone sous-ventriculaire murine récapitule les caractéristiques de la gliomagenèse précoce. Cellule cancéreuse 30, 578–594 (2016).

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Nous remercions le Wellcome Trust (091857/7/10/7), le Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L000121/1, sLoLa Grant BB/J001694/2 et BB/R013829/1), le Medical Research Council, le Engineering and Physical Sciences Research Council et Cancer Research UK (C8717/A18245) pour le financement de ce travail. RR a été soutenu par le programme doctoral Oxford-GSK-Crick en biologie chimique via le DTP interdisciplinaire en biosciences, BBSRC (BB/R506655/1) et GlaxoSmithKline. ICH remercie la Fondation Anne Grete Eidsvig et Kjell Inge Røkke pour l'éducation pour une bourse Aker. PR remercie la Deutsche Akademie für Naturforscher Leopoldina, Allemagne, pour une bourse postdoctorale. RAH est reconnaissant du financement du Fonds Clarendon et d'une bourse Birkett du Trinity College. Nous remercions le Dr Victor Mikhailov pour son aide dans les études de SP non dénaturantes et le Dr David Staunton pour la réalisation des expériences SEC-MALS. Les cellules HEK293T et les vecteurs d'encapsidation lentiviraux pMDL, pVSVg et pREV nous ont été aimablement donnés par E.Vigna du Candiolo Cancer Institute (IRCCS), Université de Turin, Italie. Nous remercions le personnel de Diamond Light Source UK pour le temps de faisceau et le soutien aux lignes de lumière I03 et I24 (proposition MX-23459).

James Wood et Melissa Morgan

Adresse actuelle : Institut de génétique et du cancer, Université d'Édimbourg, Édimbourg, Royaume-Uni

Martin I. Abboud

Adresse actuelle : Département des sciences naturelles, Université libanaise américaine, Byblos/Beyrouth, Liban

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Ingvild C. Hvinden, Patrick Rabe.

Laboratoire de recherche en chimie, Département de chimie et Ineos Oxford Institute for Antimicrobial Research, Université d'Oxford, 12 Mansfield, Oxford, OX1 3TA, Royaume-Uni

Raphael Reinbold, Ingvild C. Hvinden, Patrick Rabe, Ian J. Clifton, James SO McCullagh, Martine I. Abboud et Christopher J. Schofield

Département de chimie, Université d'Oxford, Oxford, OX1 3QR, Royaume-Uni

Ryan A. Herold et Fraser A. Armstrong

Institut du cancer et des sciences génomiques, Université de Birmingham, Birmingham, Royaume-Uni

Alina Finch, James Wood, Melissa Morgan et Chiara Bardella

Institut des sciences pharmaceutiques, Université de Fribourg, 79104, Fribourg, Allemagne

Maximilien Staudt

GlaxoSmithKline, Gunnels Wood Rd, Stevenage, SG1 2NY, Royaume-Uni

Ouais Redmond

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CJS et MIA ont conçu l'étude. RR, MIA et MS ont produit les protéines. RR a effectué des tests d'absorbance UV, des études RMN 1H, des études CD, DSF et des analyses de gel non dénaturant. RR et PR ont mené des études cristallographiques. L'IJC a appuyé l'analyse des données cristallographiques. RR a mené des études sur la SEP non dénaturante. RAH et FAA ont mené des expériences électrochimiques. AF, JW et MM ont produit et cloné les vecteurs mutants IDH. CB et AF ont généré les LV, les cellules mutantes IDH et effectué des validations. ICH et JSOM ont terminé le traitement inhibiteur des lignées cellulaires et l'analyse métabolomique. JR a soutenu les expériences d'inhibition. RR et CJS ont co-écrit l'article. Tous les auteurs ont examiné l'article.

Correspondance à Martine I. Abboud ou Christopher J. Schofield.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Christal Sohl et le(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.

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Réimpressions et autorisations

Reinbold, R., Hvinden, IC, Rabe, P. et al. La résistance à l'ivosidenib, inhibiteur mutant de l'isocitrate déshydrogénase 1, peut être surmontée par d'autres inhibiteurs de liaison dimère-interface. Nat Commun 13, 4785 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32436-4

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Reçu : 11 avril 2022

Accepté : 25 juillet 2022

Publié: 15 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32436-4

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